作为模式生物,拟南芥(Arabidopsis thaliana)主要有以下几方面的优势:
第一,拟南芥的基因组在常见的植物模型中是最小的,染色体数目也很少,只有五对同源染色体。
第二,植株体积小,对环境的适应性强,生活周期短,繁殖能力强,播种到收种需要两个月左右。
第三,自然条件下,拟南芥是严格的闭花自花传粉,基因高度纯合,易稳定遗传,强可诱变性。
第四,拟南芥研究的相关遗传手段和生化分子技术都已经比较成熟。
第五,丰富的种质资源。运用高通量转化技术得到的T-DNA插入的突变体库,已经鉴定的独立的T-DNA插入株,几乎覆盖了所有的编码基因。
获得转基因拟南芥T0代:
日常使用浸花法(floral dip method)(Clough等,1998)转化拟南芥。将拟南芥的花序放到含有农杆菌的转化介质中浸泡3~5分钟,在转化介质的帮助下,农杆菌可以穿过植物细胞壁和质膜,侵染雌配子体即胚囊,并将带有目的基因和元件的T-DNA片段整合到雌配子的基因组上(Desfeux等,2000; Bent A, 2006)。
T1T2T3获得纯合株系:
1.野生型拟南芥,称为T0代,经过侵染之后,而从T0代上收集到的种子是T1代种子(混合收种)
2.将T1代种子铺种在含有抗生素的MS培养基上,直接筛选出转基因T1代阳性的幼苗,移栽到穴盘,悉心呵护,收集到T2代种子(单株收种)。需要注意的是,T1代均为杂合子,但是并不确定是单拷贝或是多拷贝插入。
3.将T2代种子铺种在含有抗生素的MS培养基上,此时阳性苗:阴性苗(未发芽的种子不计入)如果符合3:1的分离比,则目的基因以单拷贝插入,将其中的阳性苗移栽,同样悉心呵护,收集T3代种子(单株收种)。不符合3:1则可能有多个拷贝插入不同位点(多拷贝插入往往会引起基因沉默现象,扔了算了)。
4.将T3代种子铺种在含有抗生素的MS培养基上,一段时间之后,你发现某个培养皿里全是阳性苗,恭喜!你拿到了自己的转基因纯合株系。
实用tips:
种子灭菌消毒,越到后面的时候,培养基上种子的 密度 要控制好,有能力的话最好做到粒粒分明,方便统计。
每次播种不要全部播完,给自己留条后路。你永远不知道自己会不会碰到配错培养基,抗生素加错,培养基污染,疫情开不了学苗子活活旱死等各种状况(血泪控诉)。
1篇相关文献,感兴趣可以康康:唐微.几个转基因植株后代的遗传分析[J].安徽农业科学,2007(31):9867-9868.