作者：Jenny
审稿：童蒙
编辑：angelica
近几年来，单细胞测序技术一直是讨论热度极其高的话题，除了单细胞转录组，单细胞ATAC也逐渐引起科研人员的兴趣。那么，它与我们熟知的单细胞转录组又有什么相同和不同之处呢？单细胞ATAC基础分析软件、亚群分析、motif&拟时间等高级分析与单细胞转录组又有哪些异同点？在这里，今天这篇分享主要是给大家介绍下单细胞ATAC的基本知识点，后续也会给大家带来更多关于单细胞ATAC生信分析的内容，尽请期待。
什么是单细胞ATAC？
第一个单细胞ATAC数据是2015年由Greenleaf(Buenrostro, Wu et al. 2015)和Shendure(Cusanovich, Daza et al. 2015)实验室的分别发布Nature和Science期刊上，他们通过修改ATAC-seq protocal获取了几百~上万个细胞。其中Greenleaf实验室Nature文章中是依赖物理隔离单细胞（右图），而Shendure实验室避免了单细胞反应体积使用两步组合索引策略（左图）(Pott and Lieb 2015)。
简单来说，单细胞ATAC是单细胞技术和传统ATAC-seq的结合体。我们知道，ATAC-seq（Assay for Transposase-Accessible Chromatin with highthroughput sequencing）是一种利用转座酶（改造后Tn5转座酶）来研究全基因组范围内染色质开放性的方法，而基于2018年大火的10x Genomics ChromiumTM平台的Single Cell ATAC产品同样也是利用乳状液凝胶珠GEM来获取单细胞的。
从这里我们可以看出，单细胞ATAC和单细胞转录组的实验建库有一个很明显的差异，那就是，单细胞转录组是必须要活体细胞，且是提取细胞胞质里的RNA序列，而单细胞ATAC是提取核内DNA，对细胞的状态要求较低。
为什么要进行单细胞ATAC研究？
细胞是生命活动的基本单位，而要弄清楚真核生物的基础机制，只查看基因的表达水平是往往不够的。有研究表明，人类全基因组70%的范围可以发生转录（像lncRNA、small RNA、eRNA等），而单细胞转录组更多是检测基因coding区域，这一区域占比不到5%。此外真核生物中还存在大量的顺式调控元件，在细胞发育过程中，远端的非编码区域的表观状态往往比基因表达水平的变化要大得多，而单细胞ATAC技术就是实现这一目标的可靠手段之一。
我们可以简单总结单细胞ATAC的特点：
- 细胞更容易获取，制备简单，研究范围较广。
- 可以观测到细胞全基因组表观ATAC的整体变化。
- 可以做TF, motif转录调控方面的研究。
如何要进行单细胞ATAC研究？
如今，比较流行的是10x Genome单细胞平台，目前官方已推出2款关于单细胞ATAC的产品，一个是Single Cell ATAC；另一个是去年刚推出的Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression 。
后者是可以同时检测同一个细胞的ATAC信号和转录组水平（核内RNA）。此外10x也配套发布了相应的cellrange分析软件，分别是Cell Ranger ATAC和Cell Ranger ARC。
单细胞ATAC基础数据？
01 单细胞ATAC基础数据介绍
单细胞ATAC跟单细胞转录组在数据格式类型上有比较明显的区别，不像单细胞转录组，经过cellranger分析后只需要基因表达矩阵就行。单细胞ATAC的基础依赖数据是每个样本有一个fragments.tsv文件（已经去掉duplicates），每一行代表一个unique read（fragment），并且有对应细胞barcode信息。我们可以利用这个文件得到peaks矩阵信息，但是fragments.tsv文件我们后期还是会用到（比如画track图等）。
02 单细胞ATAC基础数据获取
接下来，我们以10x Genome的Single Cell ATAC数据为例，说明如何从原始fastq文件得到下游单细胞ATAC的基础数据信息。
Cell Ranger ATAC是由10xGenomics官网提供的一组分析、处理，单细胞ATAC数据的流程软件。Cell Ranger ATAC主要包括四个与单细胞染色质可及性分析相关的pipeline: mkref（建库）、count（数据分析）、aggr和reanalyze。目前官方cellranger-atac已更新到1.2.0版本。
参考官方pipeline教程：https://support.10xgenomics.com/single-cell-atac/software/pipelines/
运行
cellranger-atac count命令，便可获取我们的基础文件。以下是下游分析需要用到的重要文件列表。有时候我们会做多个样本多个组的单细胞数据，而一些软件，比如Signac是要依赖peaks matrix作为输入文件的，这时候我们可以用
cellranger-atac aggr共同call 多个样本的peaks matrix。
- Tips：peak作为feature跟基因不一样，同一基因的位置信息都是一样的，但是每个样本的peak具体位置不一，且有时候即便是同一个peak，但是它们的start,end会有少许bp偏差，这时候就需要定义多个样本的统一peak位置信息。
以下是cellranger-atac count/ aggr具体命令：
#单个样本，多个制备文库
cellranger-atac count --id=sample_name --fastqs=QC/clean/sample_name --sample s1,s2,s3,s4 --reference=10xATAC_genome --localcores=20 --localmem=60 --dim-reduce=lsa
#多个样本，共同call peaks,因计算量大且运行时间长，不建议做下游分析（nosecondary）
cellranger-atac aggr --nosecondary --id=Rice --csv=test_aggr.csv --normalize=depth --reference=10xATAC_genome
以下是后续做亚群分析要用到的test_aggr.csv基础文件列表，包含以下具体信息：
- 1）library_id：样本名
- 2）fragments：cellrangeATAC的输出结果，同一目录下必须要有对应的*gz.tbi index文件。
假设网上下载的数据，没有*gz.tbi index文件或者是需要根据genomeAnnotation,geneAnnotation对象修改一致的Chr等命名，可以按照以下方式修改fragments重新生成tabix index。
#必须用bgzip，不能用gzip
bgzip -c fragments.tsv > fragments.tsv.gz
#生成tabix index
tabix -0 -p bed fragments.tsv.gz
-
3）cells：cellrangeATAC的输出结果，对应每个cell的barcode等信息。
今天关于单细胞ATAC的基础知识点介绍就到这里。获得了基础数据后，那么接下来就是做亚群分析了。
下次，我会继续给大家带来比较详细的有关单细胞ATAC生信的分析内容了。不要走开喔～
参考资料
- Buenrostro JD, Wu B, Litzenburger UM, Ruff D, Gonzales ML, Snyder MP,et al. Single-cell chromatin accessibility reveals principles of regulatory variation. Nature. 2015;523:486–90. #Greenleaf(Buenrostro, Wu et al. 2015)实验室
- Cusanovich DA, Daza R, Adey A, Pliner HA, Christiansen L, Gunderson KL, et al. Epigenetics. Multiplex single-cell profiling of chromatin accessibility by combinatorial cellular indexing. Science. 2015;348:910–4. https://doi.org/10.1038/nature14590 #Shendure(Cusanovich, Daza et al. 2015)实验室
- Pott, S. & Lieb, J. D. Single-cell ATAC-seq: strength in numbers. Genome biology 16, 172, doi:10.1186/s13059-015-0737-7 (2015). #这篇文章比较了Greenleaf和Shendure两个实验室文章的侧重点
- Minnoye, L., G. K. Marinov, T. Krausgruber, L. Pan, A. P. Marand, S. Secchia, W. J. Greenleaf, E. E. M. Furlong, K. Zhao, R. J. Schmitz, C. Bock and S. Aerts (2021). "Chromatin accessibility profiling methods." Nature Reviews Methods Primers 1(1). #Nature review, 比较系统介绍了单细胞ATAC
- https://support.10xgenomics.com/single-cell-atac/ #10x ATAC官方网站，cellranger-atac-1.2.0
- Cell Ranger ATAC 1.0, 1.1 and 1.2 support libraries generated by the Chromium Single Cell ATAC v1 reagent kits.
- https://support.10xgenomics.com/single-cell-multiome-atac-gex #Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression 官方网站，Cell Ranger ARC
- https://github.com/seandavi/awesome-single-cell #单细胞数据分析的软件列表，包含scRNA和scATAC等。
- Chen, H., C. Lareau, T. Andreani, M. E. Vinyard, S. P. Garcia, K. Clement, M. A. Andrade-Navarro, J. D. Buenrostro and L. Pinello (2019). "Assessment of computational methods for the analysis of single-cell ATAC-seq data." Genome Biol 20(1): 241. #整体介绍scATAC分析流程
