Cancer Cell |CAR T细胞靶向GPC2根除神经母细胞瘤

原创 huacishu 图灵基因 2022-01-19 10:52

收录于话题#前沿分子生物学机制

撰文：huacishu

IF=31.741

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亮点：

1、作者开发了表达嵌合抗原受体（CAR）的T细胞，靶向glypican-2（GPC2），一种在神经母细胞瘤（NB）和其他几种实体瘤上表达的胎儿抗原。

2、作者使用标准设计产生的CAR可以控制转基因GPC2过表达的NB，但不能控制表达临床相关的GPC2位点密度（5000分子/细胞，范围1-6×103）的NB。跨膜（TM）和共刺激结构域的迭代工程加上c-Jun的过表达降低了GPC2-CAR抗原密度的阈值，使表达临床相关GPC2抗原密度的NB得到有效和持久的根除，而且没有毒性。

3、这些研究强调了CAR设计和抗原密度阈值之间的关键相互作用，证明了适合临床测试的主要GPC2-CAR候选者的有效疗效和安全性，并证明胎儿抗原是CAR T细胞治疗实体瘤的一类有望靶点。

美国斯坦福大学医学院Crystal L. Mackall教授课题组在国际知名期刊 Cancer Cell在线发表题为“GPC2-CAR T cells tuned for low antigen density mediate potent activity against neuroblastoma without toxicity”的论文。儿科癌症通常模仿胎儿组织，并表达通常在产后沉默的蛋白质，可作为免疫靶标。作者开发了靶向glypican-2(GPC2)的嵌合抗原受体(CAR) T细胞，GPC2是一种在神经母细胞瘤(NB)和其他实体瘤上表达的胎儿抗原。使用标准设计的CARs控制过表达转基因GPC2的NBs，而不是那些表达临床相关GPC2位点的CARs。跨膜(TM)和共刺激域的迭代工程加上过表达c-Jun降低了GPC2- car抗原密度阈值，使临床相关GPC2抗原密度的NBs得以有效和持久的消除，并且无毒性。这些研究强调了CAR设计和抗原密度阈值之间的关键相互作用，证明了适合临床测试的主要GPC2-CAR候选者的有效疗效和安全性，并证明胎儿抗原是CAR T细胞治疗实体瘤的一类有望靶点。

在人原始抗原结合片段(Fab)噬菌体文库中鉴定了3个抗GPC2单链可变片段(scFvs) (GPC2.19, GPC2.27, GPC2.D4)和4个已报道的抗GPC2.D3片段(GPC2.D3)。GPC2.D4和GPC2.27需要c -末端残基(493-553)才能结合。GPC2.19 和GPC2.D3共享重叠的表位(图1A)，包括残基396-400(图1B)，这是GPC2.D3已知的成分。利用跨膜(TM)和4-1BB共刺激结构域，模拟tisagenlecleucel，一种FDA批准的CD19-CAR活性抗B细胞急性淋巴细胞胚性白血病(B- all)。作者设计了T细胞，以VH/VL和VL/VH方向表达包含每个scFv的GPC2 -CAR。具有优良的生物物理性质包括在原代激活的T细胞中稳健表达和高抗原诱导的细胞因子产量。在没有fc突变间隔区的情况下，具有VL/VH定向的D3-CAR - T细胞被优先用于进一步的测试(图1C)。作者测量了不同GPC2位点密度的NB细胞系的效价，包括高水平转基因GPC2的等基因系NGP-GPC2 (GPC2hi, 34,052个分子/细胞);NBSD，表达中等水平GPC2的细胞系(GPC2mod, 20,270个分子/细胞);以及SMS-SAN，其低水平表达GPC2 (GPC2lo, 6873分子/细胞)(图1D)，并观察到GPC2产生细胞因子。D3-和GPC2.19-CARs与GPC2抗原密度直接相关(图1E和1F)，这种依赖性在更大的NB细胞系中都成立。在体外低效靶比(1:5 E:T)下，GPC.D3-和GPC2.19-CARs能够杀死GPC2hi，但不能杀死GPC2mod或gpclo靶点(图1G-1J)。gpc19 -CARs能够控制GPC2hi异种移植，但不能控制GPC2mod和GPC2lo异种移植以来，体内对高抗原密度的需求得到了证实(图1K-1N)。

为了准确测量患者NB细胞表面GPC2抗原密度，作者开发了一种用于6种免疫治疗相关抗原的抗原密度定量检测方法。将此方法应用于9个转移性NB浸润的骨髓标本、一组细胞系和几个病人来源的异种移植(PDX)肿瘤。选择BM是因为它是NB转移的常见部位，可以不经组织酶解进行分析。根据CD45的表达情况排除造血细胞，根据CD13的表达情况排除NB不表达的骨髓基质细胞(图2A和2B)。CD45- CD13-细胞共表达NCAM和GD2，这是已知的NB相关分子(图2C)。在肿瘤人群中，测量了目标特异性抗体发出的荧光团信号，从而计算出每个细胞的目标分子。转移性NB在BM中显示出4,262±469个GPC2分子/细胞(范围为1,425-6,041)，患者间变异很小，显著低于大多数NB细胞株和PDX样本同时评估的水平(图2D)，接近于GPC2lo细胞株SMS-SAN的水平。还比较了GPC2与其他几个免疫治疗靶点的表达水平，并观察到抗原之间的抗原密度有很大的差异。GPC2水平低于GD2、NCAM和L1CAM，但高于间变性淋巴瘤激酶(ALK)和B7-H3。与GPC2相似，NCAM、L1CAM和B7-H3抗原密度显示患者间差异很小，在转移性NB中与细胞株和PDX样本相比显著降低(图2D)。来自一名患者的配对诊断/复发样本显示，在复发时，除GPC2外，每个靶点的抗原密度都有所下降，而GPC2在复发样本中略有增加。总之，这些数据强调了抗原密度在调节CAR-T细胞效力中的关键作用，与转移性NB相比，细胞系和PDX样本的水平不一致。

作者之前证明了CD28 TM结构域降低了CAR - T细胞抗原密度阈值。因此，作者比较了GPC2.D3-和GPC2.19 car-T细胞与CD28 TM±a CD28共刺激的内源性结构域替换为原始的CD8a TM结构(图3A)。这些结构变化对CAR表面表达、耗竭或T细胞分化表型没有影响，但GPC2 -CAR结合CD28 TM结构域，具有41BB或CD28共刺激结构域，证实增强了对GPC2mod和GPC2lo靶标的杀伤(图3B)，同时也增加了对GPC2mod肿瘤细胞的IL-2和IFNg的产生。在体内对GPC2lo (SMS-SAN) NB转移模型中也取得了类似的抗肿瘤作用(图3H-3K)。

为了进一步评估共刺激内域的影响，在体外压力测试中比较了结合 CD28 和 41BB 内域的 GPC2.19.CD28TM-CAR 的杀伤效果。对GPC2mod和GPC2lo NB系使用1:8 E:T比，观察到结合 CD28 共刺激内域的 GPC2-CAR 具有出色的杀伤力（图 3C）。虽然两者都在体内对具有GPC2mod抗原密度的患者来源的异种移植物（图 2D）在具有中度或高肿瘤负荷的动物中介导了显着的肿瘤消退，但含有CD28内域的动物则更为优越（图 4A-4E）。总之，这些结果表明，迭代 CAR 工程可以调整抗原密度阈值，从而能够以大约 5x103个分子/细胞有效靶向表达GPC2的细胞，远低于标准CD8a TM和41BB-CAR配置可以靶向和接近的水平。

在 GPC2.19.28TM.28z CAR T 细胞中观察到的肿瘤消退，将目标抗原密度阈值调整到正常水平，这预示着临床活动的良好前景，但由于CAR T细胞耗竭的发展，这种结构与较短的持久性有关，并可能导致获得性抵抗。在GPC2.19.28TM.28z CAR T细胞诱导CR后长期跟踪动物，并研究了一小部分动物的复发情况（图 5A）。复发性肿瘤的免疫组织化学 (IHC) 和流式细胞术显示GPC2表达降低，伴有大量CAR T细胞浸润（图 5B-5D），而其他抗原如NCAM、L1CAM 或GD2的表达没有改变（图 5C、5D ）。重新植入非CAR T细胞小鼠后，复发肿瘤上的GPC2表达恢复到基线，表明在CAR T细胞免疫压力介导的GPC2表达调节中肿瘤细胞具有高可塑性（图 5D）。

最近发现c-Jun过表达（OE）增强了CAR T细胞对低抗原肿瘤细胞的效力和持久性；因此，生成了双顺反子c-Jun.GPC2.19.28z-CAR结构（cJun.GPC2）并测试其是否增强了抗GPC2lo NBs的体内抗肿瘤活性和减少复发。和c-Jun.GPC2.19.28z相比，GPC2显示出类似的细胞表面CAR表达（图6A和6B），在不同水平抗原的杀伤能力方面优于所有其他结构。为了研究临床相关模型中的功能，将从肿瘤复发患者ST16治疗后的BM中分离的患者源性NB细胞（ST16-BM4224）植入，并以准原位方式将GFP-Luc导入肾包膜（图6C）。有趣的是，在体外扩增过程中，每个细胞的GPC2分子增加了23个（原发性NB为5450个，扩增后为10843个），并且两种CAR结构有效地清除了肿瘤（图6D）。GPC2-CAR T细胞表现出显著增强的抗肿瘤活性、CAR扩增和持久性（图6E–6G），并且在对抗表达更低抗原水平的GPC2ultralo肿瘤（3425个分子/细胞）时也显著优于原始构建物。此外，GPC2 CARs介导了高负荷GPC2hi-NB（图6H-6J）原位移植动物疾病控制持续时间和CAR持续时间的延长，并且当它们共同移植时，GPC2hi和GPC2lo肿瘤（4460个分子/细胞）清除效果相同，而GPC2.19.8TM.41BBz构建选择性靶向GPC2hi肿瘤，但完全保留GPC2lo肿瘤（图6K-6O）。这些数据表明，c-Jun OE提高了GPC2-CAR T细胞的效力，并介导了针对表达临床相关GPC2抗原密度的NBs的持久抗肿瘤活性，因此成为临床试验的主要候选药物。

接下来，作者试图评估低抗原密度调节的GPC2-CAR T细胞靶向和非肿瘤毒性的可能性。据报道，使用IHC，发现GPC2的蛋白表达在正常成人和儿童组织中非常有限。与此相一致，人类器官发育过程中GPC2基因表达的已发表数据库显示，表达仅限于发育中的大脑，在9周左右达到高峰，然后在出生后逐渐减少并完全缺失，这一模式反映在小鼠发育中的组织中。质谱数据库中的蛋白质表达证实了这一模式，表明GPC2的表达仅限于胎儿大脑，出生后仅在成人睾丸中存在。通过产前、婴儿和儿童脑组织的IHC染色，进一步证实了GPC2表达与胎龄之间的负相关（图7A），并发现NBs上的GPC2水平显著高于儿童和婴儿脑（图7B和7C），其中H分数始终<100。大量RNA测序（RNA-seq）数据集的分析可以掩盖罕见细胞类型中的基因表达。因此，分析了胎儿和成人大脑的单细胞（sc）RNA序列数据集。在胎儿人脑样本中，通过统一流形近似和投影（UMAP）聚类确定的14个不同细胞群中，GPC2主要在神经元祖细胞中表达，在由双皮质素（DCX）表达驱动的簇中表达（图7D–7E），在小鼠发育中脑中也观察到这种模式。DCX是一种微管相关蛋白，存在于未成熟、迁移的神经元祖细胞中，随着神经元成熟而下调，但在成人大脑的单个细胞中仍保持低水平表达，不再伴随GPC2表达（图6F和6G）。总之，这些数据证实GPC2是一种神经发育抗原，出生后在组织中的表达不显著，因此可能是CAR T细胞治疗的安全靶点。

接下来评估了GPC2的特异性。通过膜蛋白质组阵列，测试GPC2.19-IgG1单克隆抗体对超过5300个人类膜蛋白库的反应性，包括94%的所有单程、多程和糖基磷脂酰肌醇（GPI）锚定蛋白。在mAB浓度高达1.25 mg/mL时，未观察到脱靶结合。在>5mg/mL时，观察到低水平的脱靶结合到电压门控氢通道1（HVCN1），其主要表达在B细胞和粒细胞上。然而，GPC2.19-IgG1仅显示与B细胞和粒细胞的最小结合，而CAR T细胞不介导针对这些细胞类型的细胞毒性，表明没有生物学上显著的交叉反应。由于人类和小鼠GPC2在器官发育过程中的基因表达谱具有可比性，使用小鼠模型来评估潜在的非靶向和靶向非肿瘤相关毒性。GPC2.19对人（KD 11.0±3）和小鼠GPC2（77.2±10.2）以及GPC2具有高结合亲和力。利用先前建立的准原位肾包膜异种移植模型，测试了最有效的GPC2的毒性。尽管具有强大的抗肿瘤作用（图8C、8D），但动物体重没有减轻或出现临床毒性迹象（图8B），血细胞计数或肝功能参数也没有显著变化（图8E）。在接受c-Jun、GPC2-CAR T细胞治疗的动物的肝（2/3）和肺（3/3）中观察到细胞浸润，然而，所有组织，包括肝脏、睾丸和中枢神经系统，均在正常范围内。CTRL治疗的动物，由盲法病理学家评估（图8F）。作者得出结论，GPC2.19.28z CAR T可以在没有毒性证据的代表性疾病模型中有效控制肿瘤。

总之，这项工作强调了抗原密度对CAR T细胞效力的深刻影响，并说明了准确定量临床样本上的抗原密度和针对抗原密度阈值的CAR T细胞迭代工程的重要作用。证明了许多可获得的解决方案可用于根据所需抗原密度阈值调节CAR T细胞。使用严格的疗效和毒性模型，作者已经确定了有效的GPC2-CAR，这些可以用于NB的临床试验，以及标准疗法不足以治疗的其他多种目前致命的癌症。最后，这些数据也证明了癌胚抗原是一类非突变靶点，适合于以CAR T细胞为靶点的治疗。

教授介绍

Crystal L. Mackall博士是斯坦福大学的儿科和内科学教授。她担任Stanford Center for Cancer Cell Therapy的创始主任、Stanford Cancer Institute的副主任、Cancer Immunology and Immunotherapy Program的负责人。在27年的任期中，她在NCI儿科肿瘤分部担任主任，现在在斯坦福大学Mackall实验室，她领导了一个国际公认的基础和转化研究项目，重点关注肿瘤免疫学。她的工作确定了胸腺在人类T细胞再生中的重要作用，并发现IL-7作为T细胞稳态的主要调节因子。她进行了大量的早期和首次在人类和儿童的临床试验，涵盖了树突状细胞疫苗、细胞因子和使用NK细胞和转基因T细胞的过继免疫疗法。她的团队已经确定T细胞衰竭是限制CAR - T细胞活性的一个主要特征，并开发了新的方法来防止和逆转人类T细胞衰竭。

参考文献

Heitzeneder S, Bosse KR, Zhu Z, et al. GPC2-CAR T cells tuned for lowantigen density mediate potent activity against neuroblastoma without toxicity.Cancer Cell. 2021;S1535-6108(21)00658-9. doi:10.1016/j.ccell.2021.12.005