COVID-19疫苗对基于Omicron的变体的抗体反应较差，需要频繁加强来维持抗体水平。2023 年 5 月 25 号，加州理工学院生物与生物工程系 Pamela J. Bjorkman 教授团队在 Cell 发表文章：ESCRT recruitment to SARS-CoV-2 spike induces virus-like particles that improve mRNA vaccines，文章里他们将mRNA 疫苗与蛋白纳米颗粒疫苗相结合，编码产生可实现自我组装的包膜病毒样颗粒（eVLPs），克服了这一短处。这个可实现自我组装的包膜病毒样颗粒（eVLPs）在质膜尾部含有EABR成分，以招募ESCRT（endosomal sorting complex required for transport），使新生成的eVLP能够被细胞以出芽形式分泌。纯化的SARS-CoV-2 Spike EABR eVLPs呈现密集排列，在小鼠中引发超强的抗体反应。应用该技术构建的含有EABR的Spike mRNA-LNP疫苗比经典的mRNA-LNP能够诱导更加持久和高效的中和抗体反应及CD8 T细胞应答。在加强接种后3个月，疫苗诱导的血清对Omicron的中和抗体水平比经典的mRNA-LNP疫苗高10倍以上。因此，EABR技术是提高疫苗持久性的一个非常重要的增效技术。

一、ESCRT通过募集到刺突细胞质尾部从而诱导eVLP组装

1、Spike-EABR 抗原序列设计

将不同来源的EABR融合到S蛋白的截短的细胞质尾部，通过短的GlySer连接子从其C末端分离（图1A和1B）。S蛋白包含D614G取代、弗林蛋白酶切割位点、S2亚基中的两个脯氨酸取代（2P）以稳定融合前构象，并且C末端21残基被截短以通过去除内质网（ER）-滞留信号（DCT）来优化细胞表面表达（图1B）。我们评估了来自人CEP55蛋白的EABR片段，该片段在胞质分裂过程中结合TSG101和ALIX（图1B）。为了进行比较，从马传染性贫血病毒（EIAV）p9蛋白、埃博拉病毒（EBOV）VP40蛋白的残基1-44和HIV-1 p6蛋白中获得了在病毒出芽过程中募集早期ESCRT蛋白的病毒晚期结构域（图S1A）。假设，可以通过阻止EABR融合蛋白的内吞作用来延长蛋白质留在质膜与ESCRT蛋白相互作用的持续时间，从而增强eVLP的产生。因此，添加了内吞作用预防基序（EPM），这是一种47个残基的插入，来源于小鼠Fcγ受体FcgRII-B1胞质尾部（图1A和1B），将FcgRII-B1束缚在细胞骨架上，以防止包被凹坑定位和内吞作用。

2、为什么选择CEP55 蛋白的 EABR 片段实现自组装？

研究人员用编码S-EABR，S-p9，S-VP401-44 以及 S-p6 的质粒转染Ex-pi293F 细胞，20%蔗糖缓冲液超速离心，收集上清液，测定上清液中产生eVLP 的数量。Western blot分析显示，在S-EABR构建体中检测到最高的S蛋白水平，这表明CEP55 EABR诱导了含S的evlp的有效自组装（图1C和S1B）。S- eabr构建体稀释为1:400时，与S-p9构建体在1:40稀释时产生了相似的强烈条带，表明来自CEP55 的 EABR 高效触发 S 蛋白自组装成 eVLPs，要比 S-p9 蛋白组装的 eVLPs 高出 10 倍。CEP55 EABR能结合ALIX和TSG101 17，而EIAV p9只结合ALIX,23这表明有效的eVLP组装需要两种ESCRT蛋白的最佳募集。S-p6和S- vp401 - 44样品含有很少或没有S蛋白，这表明eVLP的组装效率低，可能是由于对ESCRT蛋白的亲和力较低（图1C和S1B）。

3、EABR序列优化处理

通过实验不同的EABR序列进一步证明了S-EABR构建体（图1B），发现添加第二个EABR结构域（S-2xEABR）减少了eVLP的产生（图1D）。为了研究S-EABR-eVLP组装是否依赖于ESCRT募集，研究人员取代与ALIX相互作用所必需的EABR残基（CEP55中的Tyr187）来产生S-EABRmut（图S1A）。纯化的S-EABR-eVLP样品在1:200稀释时产生了一个强带，而S-EABRmut在1:20稀释时却没有检测到条带，这表明S-EABRmut不再产生eVLP，募集到 ALIX 对于 eVLP 组装来说至关重要（图1D）。为了确定eVLP组装所需的最小EABR序列，研究人员设计了融合到完整EABR结构域（CEP55170–213）、EABRmin1（CEP55180–213）和EABRmin2（CEP55180-204）的S构建体（图S1A）。虽然EABRmin2的S-EABR eVLP产率降低，但EABRmin1的生产效率保持不变（图1E）。

4、评估EPM在S-EABR构建体的细胞质尾部内的作用

研究人员测试了无EPM的S-EABR构造体的eVLP产生。Western blot分析显示表明，与无EPM的S-EABR相比，S-EABR转染的细胞中检测到eVLP纯化后S蛋白的量明显多，而去除掉 EPM 序列，eVLP 产生量显著减少。表明EPM增强了eVLP的产生（图1F）。

5、比较其他 eVLP 生产方法

研究人员还将S-EABR构建体与其他需要S蛋白与结构病毒蛋白共表达的eVLP方法进行了比较，如HIV-1 Gag或SARS-CoV-2 M、N和E蛋白。Western blot分析显示，纯化的S-EABR eVLP级分含有的S蛋白比通过S和Gag或S、M、N和E的共表达产生的eVLP多至少10倍（图1G），这表明S-EABR eVLP比其他eVLP方法更有效地组装和/或结合S蛋白。纯化的S- eabr eVLPs与从转染的细胞上清中纯化的S-铁蛋白纳米颗粒相比，含有更高水平的S蛋白，在动物模型中已被证明能引起有效的免疫反应。

二、S-EABR eVLPs诱导免疫小鼠产生强效抗体反应

在C57BL/6小鼠中评估了纯化的S-EABR eVLP作为针对SARS-CoV-2的候选疫苗的潜力（图2A）。通过在20%蔗糖缓冲液上超速离心，然后进行尺寸排阻色谱（SEC），从转染的细胞上清液中纯化S-EABR eVLP，并通过定量Western blot分析测定S蛋白浓度（图S2A和S2B）。将S-EABR eVLP的免疫与纯化的可溶性S和共价连接到SpyCatcher-mi3蛋白质纳米颗粒（S-mi3）上的可溶性S进行比较。在Sigma佐剂存在的情况下，在第0天和第28天通过皮下注射对所有免疫原给予0.1 ug剂量（基于S蛋白含量计算）（图2A），研究人员通过酶联免疫吸附试验（ELISA）和体外假病毒中和试验评估血清抗体反应。

S-EABR eVLP在所有小鼠中引发了针对SARS-CoV-2（WA1变体，包括D614G取代[WA1/D614G]）的强大抗体结合和中和反应，类似于S-mi3引发的滴度（图2B和2C）。相反，在初次接种后，没有检测到可溶性S蛋白免疫的中和抗体反应。增强后，S-EABR eVLPs和S-mi3引发的中和抗体滴度增加了>10倍，比可溶性S的滴度高出>20倍（图2C）。

S-EABR eVLP引发了针对S蛋白受体结合域（RBD）的有效抗体反应（图S2C），S蛋白是抗SARS-CoV-2中和抗体的主要靶标。还通过斑块减少中和试验（PRNT）评估了血清对真实的SARS-CoV-2的反应，显示出对SARS-CoV-2 WA1的强大中和活性（图S2D）。中和滴度下降对SARS-CoV-2β和德尔塔变异株的抵抗力分别为2倍，这与编码SARS-CoV-2-WA1S蛋白的许可疫苗的研究一致。这些结果表明，纯化的S-EABR eVLP可在体内引发有效的免疫反应，并代表了一种生产纳米颗粒疫苗的替代技术，该疫苗不涉及洗涤剂介导的细胞裂解和从细胞裂解物中分离膜蛋白抗原。

三、mRNA编码的S-EABR构建体诱导细胞表面表达和eVLP出芽

与现有的基于纳米颗粒的疫苗方法相比，EABR-eVLP技术的一个关键优势是S-EABR构建体可以很容易地作为mRNA疫苗递送，因为eVLP组装和细胞表面表达都只需要表达单个基因编码的成分。虽然传统的新冠肺炎mRNA疫苗通过S蛋白的细胞表面表达诱导抗体反应，信使核糖核酸介导的S-EABR构建体的递送可以增强B细胞的激活，因为S-EABR蛋白不仅会在细胞表面表达，还会诱导从细胞中出芽并分布在体内的eVLP的组装，以激活免疫细胞。

为了研究S-EABR-eVLP的基因编码是否能增强基于严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2型S的mRNA疫苗的效力，研究人员首先合成了编码S、S-EABR、S-EPM或S-EABR/no-EPM的核苷修饰的mRNA。在HEK293T细胞中体外转染mRNAs 48小时后，通过流式细胞术和Western blot分析评估细胞表面表达和eVLP组装，表明与S-EABR融合蛋白相比，S的表面表达更高（图3B）。虽然添加EPM对S表面表达几乎没有影响，但去除EPM降低了S-EABR构建体的表达水平。上清液的Western blot分析证实，S和S-EPM转染在上清液中未产生可检测的eVLP，而在S-EABR转染细胞的上清液中明显检测到eVLP（图3C）。S-EABR/no-EPM的eVLP产生减少，这与流式细胞术结果（图3B）一起表明，添加EPM增强了S-EABR细胞表面表达和eVLP组装。

四、与传统疫苗相比，S-EABR信使核糖核酸LNP可引发更高的抗体滴度

1、在BALB/c小鼠中评估eVLP产生对mRNA疫苗效力的影响。

如新冠肺炎mRNA疫苗在小鼠中的临床前研究所述，在第0天和第28天以2 mg mRNA的剂量肌肉内（IM）施用mRNA-LNP。mRNA LNP免疫也与在Addavax佐剂存在下注射IM的纯化的S-EABR eVLP进行比较。prime后，S和S-EABR mRNA LNP引发的针对SARS-CoV-2S蛋白的抗体结合反应明显高于纯化的S-EABR eVLP（图4B）。然而，最高的中和抗体滴度是由纯化的S-EABR eVLP引起的，其显著高于由S mRNA LNP引起的滴度（图4C）。

S-EABR mRNALNP的几何平均中和滴度分别比纯化的S-EABR eVLP和S mRNA LNP引发的滴度高5.1倍和5倍（图4C和4D）。增强后3个月（第112天），与纯化的S-EABR eVLP和S mRNA LNP相比，S-EABR mRNA LNP的平均中和滴度分别高5.9倍和6.8倍，表明血清中和活性的增加是持续性的。

2、评估血清对SARS-CoV-2挥发性有机物的中和活性。

与S mRNA LNP相比，S-EABR mRNA LNP在第56天和第112天分别引发了4.9倍和6.5倍的针对Delta变体的平均中和反应，以及4.6倍和9.4倍的滴度。针对奥密克戎BA.1，除接受S-EABR mRNA LNP的小鼠外，所有组的中和抗体反应均显著下降，在第56天和第112天，该小鼠的中和滴度分别比S mRNA LNP高15.1倍和9.5倍，比纯化的S-EABR eVLP高20.7倍和15.4倍。

这些结果说明，与传统的基于信使核糖核酸和蛋白质纳米颗粒的疫苗方法相比，信使核糖核酸介导的S-EABR eVLP的递送增强了小鼠体液免疫反应的效力和广度。观察到的对基于奥密克戎的挥发性有机物的中和活性的改善显著大于最近批准的二价mRNA加强针的1.5倍，这表明基于S-EABR mRNA-LNP的加强免疫可以诱导比当前新冠肺炎疫苗更有效和持久的对基于奥密克戎和新出现的挥发性有机化合物的免疫力。

五、S-EABR mRNA LNP诱导强大的T细胞反应

在第112天（增强后3个月），从免疫小鼠中分离脾细胞，通过酶联免疫吸附点（ELISpot）测定分析T细胞反应。用一组SARS-CoV-2S特异性肽刺激脾细胞，并测量INF-g和IL-4的分泌以评估T细胞的活化。编码S和S-EABR构建体的mRNA LNP诱导了有效的INF-g反应，与S特异性细胞毒性CD8+T细胞和T辅助因子1（TH1）细胞免疫反应一致。相反，用纯化的S-EABR eVLP免疫的小鼠几乎检测不到INF-g反应。这些结果是预期的，因为mRNA LNP免疫导致S或S-EABR免疫原的细胞内表达和激活CD8+T细胞的抗原肽的MHC I类呈递，这在基于蛋白质纳米颗粒的疫苗中并不常见。

与S mRNA LNP和纯化的S-EABR eVLP相比，S-EABR mRNA LNP诱导了显著更强的IL-4反应，与强大的TH2细胞免疫反应一致。虽然对S mRNA LNP和纯化的S-EABR eVLP分别观察到TH1-和TH2-偏向性反应，但S-EABR mRNA LNP诱导了平衡的TH1/TH2反应，从而有效刺激细胞和体液免疫反应。因此，S-EABR mRNA LNP保留了传统S mRNA LNP激活强效细胞毒性CD8+T细胞应答的能力，同时也有效激活TH2 CD4+T细胞反应以增强体液免疫应答，从而提高抗体的效力和广度。

六、结论

与现有的基于蛋白质纳米颗粒的疫苗方法相比，采用参与细胞分裂病毒出芽的ESCRT 通路来驱动 eVLP 的组装和释放，可产生更高数量的 eVLP 。EABR 技术表现出更加吸引人的特征：

1、eVLP生产只需要表达单个组分

2、跨膜蛋白保留在其天然膜相关构象中，以确保最佳的蛋白质表达和稳定性，

3、完全组装的eVLP可以直接从培养上清液中纯化，而不需要洗涤剂介导的细胞裂解和从细胞裂解物中分离膜蛋白抗原。