NECAT是肖传乐老师团队开发的一个针对Nanopore数据组装的软件，目前该工具尚未发表，除了https://github.com/xiaochuanle/NECAT有软件的介绍外，暂时没有中文资料介绍NECAT的使用。
太长不看的结论: Nanopore的组装推荐用下NECAT。组装之后是先用MEDAKA做一遍三代polish，然后用NextPolish默认参数做二代polish。
这篇将会以一篇发表在Nature Communication上的拟南芥nanopore数据介绍如何使用NECAT进行组装，运行在CentOS Linux release 7.3.1611 (Core)，64G为内存， 20线程(Intel(R) Xeon(R) CPU E5-2640 v4 @ 2.40GHz)，下面是正文。
软件安装
NECAT可以在https://github.com/xiaochuanle/NECAT/releases/页面获取最新的软件下载地址，这里下载的是0.01版本。
wget https://github.com/xiaochuanle/NECAT/releases/download/v0.01/necat_20190307_linux_amd64.tar.gz
tar xzvf necat_20190307_linux_amd64.tar.gz
export PATH=$PATH:$(pwd)/NECAT/Linux-amd64/bin
目前0.01版本不支持gz文件作为输入，但后续版本应该会支持。
实战
第一步: 新建一个分析项目
mkdir NECAT && cd NECAT
以发表在NC上的拟南芥数据为例, 下载该数据
# 三代测序
wget ftp://ftp.sra.ebi.ac.uk/vol1/fastq/ERR217/003/ERR2173373/ERR2173373.fastq.gz
seqkit seqkit fq2fa ERR2173373.fastq.gz | gzip -c > ERR2173373.fasta
第二步: 创建配置文件
necat.pl config ath_config.txt
配置文件中，主要修改如下几个参数
PROJECT=athaliana #项目名
ONT_READ_LIST=read_list.txt #read所在路径文件
GENOME_SIZE=120000000 #基因组大小
THREADS=20 # 线程数
MIN_READ_LENGTH=3000 # 最短的read长度
CNS_OUTPUT_COVERAGE=45 # 用于组装的深度
参数中还有一个，NUM_ITER=2，它并非是简单的重复2次纠错，它的每一轮的校正目的其实不同，第一轮的优先级是敏感度(senstitive)， 第二轮之后主要追求速度(fast)。
除了上面的配置参数外，其他参数可以不需要修改，使用默认的值即可。需要修改的话，参考最后的参数说明部分。
第三步: 序列纠错
necat.pl correct ath_config.txt &
纠错后的reads在athaliana/1-consensus/cns_final.fasta
cns_finla.fasta的统计信息会输出在屏幕中， 或者自己用fsa_rd_stat也能得到同样的结果
Count: 206342
Tatal: 3102480870
Max: 112992
Min: 1010
N25: 31940
L25: 18989
N50: 21879
L50: 48506
N75: 13444
L75: 93215
此外我还用time获取了运行时间，纠错花了大概一个小时。
real 55m31.451s
user 815m32.801s
sys 7m55.039s
第四步: contig组装
necat.pl assemble ath_config.txt &
结果在athaliana/4-fsa/contigs.fasta
关于contigs.fata统计信息会输出在屏幕上，同样用fsa_rd_stat 也可以。
Count: 162
Tatal: 122293198
Max: 14562810
Min: 1214
N25: 13052494
L25: 3
N50: 9503368
L50: 5
N75: 4919866
L75: 10
时间用了75分钟
real 74m53.127s
user 1308m29.534s
sys 12m5.032s
第五步: contig搭桥
necat.pl bridge ath_config.txt
结果在athaliana/6-bridge_contigs/bridged_contigs.fasta
Count: 127
Tatal: 121978724
Max: 14562810
Min: 2217
N25: 13193939
L25: 3
N50: 11146374
L50: 5
N75: 5690371
L75: 9
从N50和N75可以看出这一步会提高组装的连续性。
组装结果polish
对Nanopore组装结果进行polish的常用软件有下面3个
由于拟南芥的基因组比较小，我分别用了Medaka和racon对输出结果进行polish(因为没有原始信号数据，因此nanopolish用不了)，代码如下
Medaka
NPROC=20
BASECALLS=ERR2173373.fasta
DRAFT=athaliana/6-bridge_contigs/bridged_contigs.fasta
OUTDIR=medaka_consensus
medaka_consensus -i ${BASECALLS} -d ${DRAFT} -o ${OUTDIR} -t ${NPROC} -m r941_min_high
参数目前发生了变化，具体Medaka的使用参考https://github.com/nanoporetech/medaka
三轮Racon:
gzip -dc ERR2173373.fastq.gz > ERR2173373.fastq
minimap2 -t 20 ${DRAFT} ERR2173373.fastq > round_1.paf
racon -t 20 ERR2173373.fastq round_1.paf ${DRAFT} > racon_round1.fasta
minimap2 -t 20 racon_round1.fasta ERR2173373.fastq > round_2.paf
racon -t 20 ERR2173373.fastq round_2.paf racon_round1.fasta> racon_round2.fasta
minimap2 -t 20 racon_round2.fasta ERR2173373.fastq > round_3.paf
racon -t 20 ERR2173373.fastq round_3.paf racon_round2.fasta> racon_round3.fasta
在后续评估质量的时候，我发现单纯用三代polish的结果还不是很好，因此我用他们提供的二代测序，用NextPolish对NECAT的结果进行polish。
# 二代测序
prefetch ERR2173372
fasterq-dump -O . ERR2173372
run.cfg内容如下, 其中sgs.fofn记录的就是解压后的ERR2173372_1.fastq和ERR2173372_2.fastq的路径
[General]
job_type = local
job_prefix = nextPolish
task = 1212
rewrite = no
rerun = 3
parallel_jobs = 8
multithread_jobs = 20
genome = input.fasta
genome_size = auto
workdir = ./nextpolish
polish_options = -p {multithread_jobs}
[sgs_option]
sgs_fofn = ./sgs.fofn
sgs_options = -max_depth 100 -bwa
我考虑了两种情况，一种是直接用二代polish，另一种是三代polish之后接二代polish。
结果评估
在计算时间上，我之前用Canu跑了相同的数据，设置原始错误率0.5，纠错后错误率为0.144，用3个节点（每个节点12个线程），运行了3天时间，但是NECAT只需要3个小时左右就能完成相同的分析，这个速度差异实在是太明显了。
用Minimap2 + dotPlotly绘制CANU，NECAT和拟南芥参考基因组的共线性图
minimap2 -t 20 -x asm5 Athaliana.fa NECAT.fa > NECAT.paf
pafCoordsDotPlotly.R -i NECAT.paf -o NECAT -l -p 10 -k 5
minimap2 -t 20 -x asm5 Athaliana.fa CANU.fa > CANU.paf
pafCoordsDotPlotly.R -i CANU.paf -o CANU -l -p 10 -k 5
NECAT的结果
CANU的结果
NECAT和CANU都和参考基因组有着良好的共线性，但是NECAT的连续性更好，几乎成一条直线。
之后，我使用了QUAST来评估Canu，NECAT初步组装，NECAT用Medaka， nanopolish和racon纠错的结果（MD: MEDAKA, RC: RACON, NP:NextPolish）。
quast.py -t 100 --output-dir athaliana --circos \
CANU.fa \
NECAT.fa \
NECAT_MD.fa \
NECAT_MD_NP.fa \
NECAT_NP.fa \
NECAT_RC.fa \
NECAT_RC_NP.fa \
-r Athaliana.fa \
-g TAIR10_GFF3_genes.gff &
一些描述基本信息
CANU N50 = 4875070, L50 = 7, Total length = 114689024, GC % = 36.09
NECAT N50 = 11146374, L50 = 5, Total length = 121978724, GC % = 36.50
NECAT_MD N50 = 11216803, L50 = 5, Total length = 122101599, GC % = 36.54
NECAT_MD_NP N50 = 11405151, L50 = 5, Total length = 124142955, GC % = 36.30
NECAT_NP N50 = 11399084, L50 = 5, Total length = 124735066, GC % = 36.36
NECAT_RC N50 = 11212098, L50 = 5, Total length = 122519370, GC % = 36.4
NECAT_RC_NP N50 = 11406553, L50 = 5, Total length = 124618502, GC % = 36.34
在BUSCO完整度上， 以embryophyta_odb10作为物种数据库, 其中ONTmin_IT4是发表的文章里的结果, Athalina则是拟南芥的参考基因组，我们以它们的BUSCO值作为参照。
Athalina : C:98.6%[S:98.0%,D:0.6%],F:0.4%, M:1.0%, n:1375
ONTmin_IT4 : C:98.4%[S:97.7%,D:0.7%],F:0.7%, M:0.9%, n:1375
CANU : C:22.9%[S:22.8%,D:0.1%],F:20.2%,M:56.9%,n:1375
NECAT : C:36.6%[S:36.6%,D:0.0%],F:22.9%,M:40.5%,n:1375
NECAT_MEDAKA : C:53.6%[S:53.2%,D:0.4%],F:21.0%,M:25.4%,n:1375
NECAT_RACON : C:45.3%[S:45.2%,D:0.1%],F:23.1%,M:31.6%,n:1375
二代Polish后的BUSCO结果如下(MD: MEDAKA, RC: RACON, NP:NextPolish)：
Athalina : C:98.6%[S:98.0%,D:0.6%],F:0.4%,M:1.0%,n:1375
ONTmin_IT4 : C:98.4%[S:97.7%,D:0.7%],F:0.7%,M:0.9%,n:1375
NECAT_NP : C:98.6%[S:97.9%,D:0.7%],F:0.4%,M:1.0%,n:1375
NECAT_MD_NP: C:98.7%[S:98.0%,D:0.7%],F:0.4%,M:0.9%,n:1375
NECAT_RC_NP: C:98.5%[S:97.8%,D:0.7%],F:0.4%,M:1.1%,n:1375
从以上这些数据，你可以得到以下几个洞见:
- 在Nanopore的组装上，NECAT效果优于Canu，无论是连续性还是N50上
- MEDAKA三代polish效果好于RACON。在速度上，MEDAKA比三遍RACON都慢，并且MEDAKA会将一些可能的错误组装给打断
- Nanopore的数据用NECAT组装后似乎用NextPolish进行polish后就行，但是由于物种比较小，可能不具有代表性。
结论: Nanopore的组装建议用NECAT。组装之后是先用MEDAKA做一遍三代polish，然后用NextPolish默认参数做二代polish。
配置文件补充
这部分对配置文件做一点简单补充。
下面这些参数相对简单，不需要过多解释，按照自己需求修改
- CLEANUP: 运行完是否清理临时文件，默认是0，表示不清理
- USE_GRID: 是否使用多节点, 默认是false
- GRID_NODE: 使用多少个节点，默认是0，当USE_GRID为true时，按照自己实际情况设置
以下的参数则是需要根据到具体的软件中去查看具体含义，需要和软件开发者讨论
- OVLP_FAST_OPTIONS: 第二轮纠错时, 传给
oc2pmov - OVLP_SENSITIVE_OPTIONS: 第一轮纠错时, 传给
oc2pmov - CNS_FAST_OPTIONS: 第二轮纠错时，传给
oc2cns - CNS_SENSITIVE_OPTIONS: 第一轮纠错时，传给
oc2cns - TRIM_OVLP_OPTIONS: 传给
oc2asmpm - ASM_OVLP_OPTIONS: 传给
oc2asmpm - FSA_OL_FILTER_OPTIONS: 参数传给
fsa_ol_filter - FSA_ASSEMBLE_OPTIONS: 参数传给
fsa_assemble - FSA_CTG_BRIDGE_OPTIONS: 参数传给
fsa_ctg_bridge
