免疫荧光和流式的抗体应该怎么购买和选择？??
通过数据分析我们找到了一些基因，可以特征表示某些特异的细胞亚群，那么如果设计和购买这些基因的抗体呢？
免疫荧光抗体购买遵循以下原则：
1. 注意实验动物，一抗来源，二抗来源的种属问题。
假设实验动物是小鼠，购买的一抗要避开mouse来源，避免在使用二抗时引入高背景反应。例如一抗可以选择大鼠或者兔源，二抗选择大鼠抗兔或者山羊抗兔的不同荧光素或者生物素或者链霉亲和素的抗体。做免疫荧光或者流式分选时，二抗选择带荧光素的即可。做beads分选时，二抗选择带生物素或者链霉亲和素就可。
2.注意抗体亚型问题
参考：抗体结构和同型| Abcam中文官网
我们都知道抗体有不同的亚型，根据 Y 单体的数量和重链的类型，可将哺乳动物体内的抗体分为五种同型：IgG、IgM、IgA、IgD 和 IgE。这些同型在生物特性、功能区域以及结合不同抗原的能力方面均有所不同：
重链
重链类型限定了抗体的类别。哺乳动物的 Ig 重链有 5 种，用希腊字母表示为：α、δ、ε、γ 和 μ。这些重链分别存在于 IgA、IgD、IgE、IgG 和 IgM 抗体中。重链的大小和组成各不相同，α 和 γ 大约含有 450 个氨基酸，而 μ 和 ε 大约含有 550 个氨基酸。
每一条重链有两个区域：恒定区与可变区。恒定区在同型一致的所有抗体中都是一样的，但不同型的抗体之间则有差异。γ、α 以及 δ 型重链具有由三个 Ig 结构域串联而成的恒定区，并且还有一个用于增加灵活性的铰链区；而 μ 及 ε 型重链则具有由四个 Ig 结构域组成的恒定区。不同 B 细胞所产生抗体的重链可变区是不相同的，但同一个 B 细胞或 B 细胞克隆所产生的所有抗体的可变区是相同的。每条重链的可变区大约为 110 个氨基酸长度，并由单一的 Ig 结构域组成。
轻链
哺乳动物的轻链仅有 λ 和 κ 两种类型。轻链具有两个连续的结构域：一个恒定结构域和一个可变结构域。轻链的长度大约为 211-217 个氨基酸。每个抗体含有的两条轻链通常相同。在如软骨鱼纲及真骨下纲的低级脊椎动物中，还可发现其它类型的轻链，如 iota (ι) 型链。
F(ab) 和 Fc 区
抗体的 Y 形单体可分为三部分：两个 F(ab) 区和一个 Fc 区。F(ab) 区包含结合同源抗原的可变结构域。Fc 片段在淋巴细胞的表面上提供了内源 Fc 受体的结合位点，Fc 片段同时也是二抗的结合位点。此外，染料和酶可以共价结合到抗体的 Fc 部分，以便进行可视化实验研究。
可通过胃蛋白水解酶将抗体裂解为两个 F(ab) 片段和一个 Fc 片段。抗体片段在某些免疫化学技术中具有独特的优势。片段化 IgG 抗体有时也很有用，由于缺少 Fc 区，F(ab) 片段 (1) 不会沉淀抗原；并且 (2) 在活体研究中也不会被免疫细胞捕获。因为分子量小且缺乏交联功能（由于 Fc 区丢失），Fab 片段常用于功能研究中的放射性标记。Fc 片段还常用作组织化学染色过程中的 Fc 受体阻断剂。
因为二抗的结合位点是一抗的Fc段，所以我们在购买抗体时要注意，二抗要买抗一抗相应亚型的，比如一抗是lgG亚型的，二抗就必须要买抗lgG亚型的。
3. 多重染色问题
在做多个抗体的染色如免疫荧光时，要避免选择不同种属来源的一抗。比如实验动物是小鼠，一抗选择兔源CD3，大鼠源CD8，二抗可以相应选择羊抗兔-APC，羊抗大鼠-PE(荧光素可以随便选择)；如果一抗选的是兔源CD3,兔源CD8,那么二抗选择羊抗兔-APC，羊抗兔-PE就会造成很高的背景，导致无法区分CD3和CD8。
还有一个问题，比如你的实验动物是小鼠，但是你的一抗市面上只有小鼠源的一抗，这样二抗进行孵育时，不仅可以结合一抗的Fc段，也可以实验动物小鼠的内源性各种细胞上的Fc段，这样就会造成很高的背景。有什么解决方法呢？
可以采用特定试剂盒，如Mouse on Mouse(M.O.M.™)Immunodectection Kits，原理也是先封闭内源的lgG.当然不用试剂盒的话可以，参考小鼠抗小鼠(MOM)染色方案| Abcam中文官网，
封闭内源性 IgG
常规准备组织切片。
常规封闭步骤中，在室温下用血清（来自与二抗相同的种属）封闭 30 分钟。
用 PBS Tween 20 洗 3×2 分钟。在室温下使用未偶联的亲和纯化 F(ab) 片段抗小鼠 IgG (H+L) 孵育切片 1 小时，或在 4℃ 下孵育整夜。该封闭抗体试用浓度为 0.1 mg/ml，不过最佳浓度需要由最终用户确定。
另外关于抗体用量的问题：
我们一般看到抗体官网给的用量比如是10^6/100ul 0.2ug,加入你的细胞总量在106，没有达到107,那么一般用0.2ug问题不大；如果细胞总量达到10^7，那么你用多大用量？
这个用浓度和体积来考虑，10^6/100ul 0.1ug，110^7/200ul浓度实际上是5106/100ul，实际细胞浓度是一样的，不过总量翻了一倍（因为体积翻倍了），所以1*107/200ul的体系给0.2ug就可以。主要是110^7前面的1，换成2就变成2倍，5就变成5倍。其实9106/100ul和1*107/100ul也没有啥区别。
