今天给大家分享一篇2019年11月发表在cell上的一篇文章， 这篇文章通过对未分化的结肠炎，Crohn’s 疾病，溃疡性结肠炎的儿童做单细胞和风险分析找到了普遍的发病机制，并且通过dipyridamole药物（潘生丁）调控cAMP信号，揭示了潜在的治疗益处。
Hights:
1 有缺陷的cAMP反应构成了儿童结肠炎的粘膜免疫缺陷。
2 在IBD中，血小板在结肠粘膜中被激活。
3 在一项研究中，潘生丁促进了9个结肠炎儿童粘膜的愈合。
4 候选的risk 基因富集在不同的粘膜细胞子集里。
summary
IBD对婴儿和儿童的生长具有显著的影响。 关于这个疾病的发病机制依然理解的不是很透彻。 在这篇文章中，他们对患有未分化的结肠炎儿童做了单细胞聚类，免疫表型以及风险基因的分析。他们证明了疾病特有的特征，以及显著 的cAMP反应信号。 PDE4B-和TNF表达的巨噬细胞的浸润，显著的减少CD39表达的T细胞的丰度，以及血小板聚集和5-羟色胺在结肠粘膜释放在结肠炎和IBD患者中很常见。在一个初步的研究中，利用潘生丁去靶向治疗这些patways，可以很好的恢复免疫稳态 ， 以及改善结肠炎的情况。 总的来说对于结肠炎粘膜的综合的分析，揭示了IBD的致病机制以及靶向治疗。
Introduction
人类的肠粘膜包含单层的上皮细胞，上皮的基质和免疫细胞。 一个完整的上皮细胞可以阻挡未消化的食物蛋白，微生物和病原菌阻止激活免疫细胞。成分和功能性的改变免疫细胞和非免疫细胞怕与IBD的形成有关。目前对PIBD肠膜的综合分析是缺少的，关于风险基因的效应以及疾病的发育依然没有讲清楚。
在这篇文章里，他们利用单细胞RNA-seq的方法，B细胞和T细胞受体文件，和免疫表型关于中国儿童的肠膜。 他们描述了疾病相关的特征，以及多个发病机制都是依赖于cAMP的缺陷反应pathway。 他们发现了潘生丁可以抑制巨噬细胞的浸润，减少肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的表达，增长CD39的表达在上皮T细胞，抑制了结肠粘膜中的血小板聚集，并且在一个初步的包含了8个具有结肠炎儿童和一个未定义的IBD儿童的研究中提高了临床反应。
results:
1 Cohort Characteristics and Single-Cell Profiling of the Colonic Microenvironment
(结肠微环境的种群特征以及单细胞文件)
他们分析了306个儿童，来自与医院2016年到2019年的样本。在这群样本中，具有正常表型的样本被认为是control（n=94），51个病人被诊断为IBD，包括40个CD，6个UC和5个IBDU样本。 剩余的（n=161）显示了临床的，活检的的不同的组织严重性。他们把这些儿童命名为轻度（grade1），中度，严重（grades2-3）未分化的结肠炎。 在本组中，56名儿童在组织学检查中每高功率场(HPF)有20个嗜酸性粒细胞计数，在相关分析中他们被标记为结肠炎嗜酸性粒细胞。显著比例的中度/重度结肠炎和IBD患者在内镜检查时血液中的血红蛋白(HGB)和白蛋白(ALB)降低，高敏c反应蛋白(hsCRP)升高，提示黏膜完整性受损、营养不良和全身炎症。
他们对免疫细胞（CD45+）和非免疫细胞（CD45-）细胞做了单细胞RNA-seq分析，来自control(n=6), 结肠炎（n=6），UC（n=2）和CD（n=3). 每一个病人都做了单细胞的免疫细胞的VDJ富集。数据预处理以及质控后，一共获得了65，367个免疫细胞和7，798个非免疫细胞。这些细胞被分成了9个groups通过无监督聚类。 并根据marker对每一类进行标注。图S1E提供了一个免疫细胞验证数据集(GEO: GSE121380)，该数据集通过混合对照和混合PIBD患者的样本进行验证。
为了揭示基因组的贡献在黏膜内稳态修复受损上面，我们用210例(包括21例IBD受试者)病人和614名年龄和性别匹配的健康对照受试样本进行一项全基因组关联研究(GWAS)分析。然后我们做了gene-based分析，以增强我们捕捉候选风险基因的可信度(Li等人，2012年)。这项分析在我们的队列中鉴定了244个可能导致PIBD风险的基因(表S3)。（这个分析是gene based分析还是GWAS分析)。
2 Novel Risk Genes Expressed in Epithelial Cells Contribute to PIBD Pathogenesis
（存在于上皮细胞的风险基因的表达贡献与PIBD的发病机制）
我们捕获了6960个上皮细胞并将它们分成亚簇，根据前面定义的10个子集(图2A和2B)标记基因(Parikh et al.， 2019)，之后集群特异性鉴定了差异表达转录因子(TFs)(图2)。结肠干细胞(ASCL2+LGR5+SMOC2+)吸收性(FXYD3+FABP1+SLC26A2+)和分泌性(HEXIM1+METTL12+)祖细胞(图S2A和S2B)存在于三个未分化的集群。结直肠上高度表达负责营养吸收和代谢的基因(FABP1和AQP8)，细胞外氧化还原稳态(SEPP1)和Cl / HCO3离子转运体(SLC26A3)参与在上皮紧密连接维护(Ding et al.， 2018)。ph敏感结肠细胞(BEST4+OTOP2+)表达GUCA2A，激活鸟苷酸环化酶c的内源性配体(cGMP)，调节胃肠液电解质平衡以及屏障完整性(Brenna et al.， 2015)。杯状细胞表达上皮修复肽(TFF3) (Aamann等，和分泌intelectin (ITLN1)可能起作用在对微生物的监视和防御系统中(Wesener et al.， 2015)。Paneth细胞表达抗微生物a-防御素(DEFA5和DEFA6)和溶菌酶(LYZ)。Tastechemosensory簇细胞表达TRPM5可能介导通过IL17RB和IL13RA1与2型ILCs (ILC2)进行串扰(Howitt et al.， 2016)。肠内分泌细胞表达嗜铬粒蛋白(CHGA和CHGB)和分泌granin (SCG2, SCG3，以及SCG5家族的肽激素，它们在新陈代谢中起作用葡萄糖稳态，情绪行为和疼痛通路(Bartolomucci等人，2011;Taupenot等人，2003)。
然后我们将候选的PIBD风险基因叠加在上皮效应细胞和干或祖细胞亚型(图2D)和2 e)。ERN1，与乳糜泻和UC的风险和调节有关未折叠蛋白反应(Kaser et al.， 2013)，高表达在干细胞，祖细胞和肠道内分泌中细胞。韩国人群PSMA6与乳糜泻风险相关(Hong et al.， 2018)，在stem和tuft细胞中表达。DVL1通过b-catenin和WNT影响上皮再生(Gao and Chen, 2010;莫帕尔希和科赫，2019)，在干细胞和分泌性祖细胞中表达(图2F)。CASP7，介导感染诱导上皮细胞效应半胱天冬酶引起细胞死亡(Saavedra et al.， 2018)，在结肠细胞中表达和结肠上皮细胞-BEST4细胞。PIEZO1,机械激活离子通道，在杯状细胞中表达。因此,PIBD风险基因的表达可能导致损伤上皮完整性和应激反应
3 Fibroblasts and Endothelial Cells from PIBD Subjects Are Enriched with Inflammatory, Matrix Remodeling, and Type I Interferon Signatures
（纤维细胞和内皮细胞来自与PIBD病人，具有炎症，matrix remodeling和type 1 干扰的signatures）
我们将成纤维细胞分成7个亚群(图3A)，根据预定义标记的表达对其进行命名基因(Kinchen et al.， 2018)， TFs，上皮下位置，和功能(图3B和S2C)。Myofibroblasts高度表达收缩基因MYH11和ACTA2(-平滑肌肌动蛋白(a-SMA)表达，而血管周细胞表达RGS5。上皮近端成纤维细胞表达IV型薄片胶原(COL4A5和COL4A6)，骨形态发生蛋白(BMP2和BMP5)， WNT5A和分泌型Wnt拮抗剂可能调节上皮再生的FRZB。固有层成纤维细胞表达分泌的金属蛋白酶ADAMDEC1，CCL8和促炎基质蛋白聚糖DCN(一种内源性配体，激活toll样受体2和-4 [TLR2/TLR4]) (Merline等，2011))。Fibroblast-TACI表示细胞激活受体TNFRSF13B (TACI)可能中和APRIL (TNFSF13)并降低配体可用性是B细胞产生免疫球蛋白A (IgA)所必需的(Sakurai et al.， 2007)。成纤维细胞taci也表达CCL19和可能促进直流浸润的CCL21 (Scandella et al.，2004)。成纤维细胞wnt2bhi细胞可能调节通过WNT家族配体WNT2B (Valentaet al ., 2016)。值得注意的是，UC受试者只携带an表达IL1B-和il6的炎症成纤维细胞亚群(图3 c);一种由TWIST1-组成的正反馈回路PRRX1-TNC可能促进其激活(Yeo等，2018)(图S2D)。
在成纤维细胞亚群的DEGs比较揭示参与TNF，核因子的基因富集活化B细胞(NF-kB)信号通路k光链增强剂，应激反应在WNT2Bhi和炎症成纤维细胞中(图3 d)。炎性成纤维细胞也富集含有一组调节细胞外基质组织的基因(表S4)。I型干扰素(IFN)受体IFNAR1是一种CD风险基因(Jostins等，2012)，刺激后ifn的高表达在CD患者(FA721)中发现了基因(ISGs)(图S2E)。需要进一步的研究来阐明IFN通路在CD发病机理。
PIBD与对照组内皮细胞的比较发现调控血管生成的基因上调白细胞渗出血管(图3E;表S4)。免疫荧光染色明显证实表达内皮细胞PECAM1 (CD31)的丰度增加PIBD中的细胞(图3F)。值得注意的是，PECAM1和SELE，调节血小板和白细胞跨内皮的基因迁移(Muller et al.， 1993)是我们的PIBD危险基因群组(图S2F)。IL33，促进结肠的警报调节性T细胞(Treg)在IBD中的分化与适应(Schiering et al.， 2014)内皮细胞高表达细胞。
4 Myeloid Cells Accumulate at the Colonic Mucosae in PIBD and Are Hyper-Inflammatory
（髓系细胞在PIBD病人的肠粘膜累积，并且具有超级炎症）
相比之下，我们发现PIBD中的髓细胞更为丰富与对照受试者(图4A)。这些骨髓细胞被分成10个亚组，所有的亚组都表达CD68(图4B和4C)。我们指定了四个骨髓亚群为巨噬细胞根据CD14的高表达。两个巨噬细胞亚群高表达TNF、IL1B和FCGR1A，后者是一种IgG高亲和力受体，促进白细胞介素b (IL-b)的表达与Th17细胞的致病性扩张。 在UC (Castro-Dopico et al.， 2019)。五个骨髓子集被定义为DCs，其中一个高表达IL1B但是缺乏TNF的表达。hyper-inflammatory骨髓的即巨噬细胞- il1bhi TNF +、巨噬细胞-以S100A8 hi IL1B hi TNF+、DC-IL1B hi细胞主要存在PIBD，但在对照组缺失(图4D)。比较这些细胞与对照组中相应的细胞显示了多个基因的差异表达(图S3A) 。这些基因被预测会促进NF-kB激活，TNF的表达，细胞存活，以及对细胞因子和类固醇的反应激素(图4 e)。值得注意的是，CXCR4高表达在超炎性髓细胞中被发现(图4C)。CXCR4的配体(CXCL12)由成纤维细胞和内皮细胞产生(图3B)。
我们进行免疫荧光染色并证实了这一点，肿瘤坏死因子-a，英夫利昔单抗的靶点，一种常用的抗体治疗IBD患者，CD68+巨噬细胞明显增加在PIBD结肠黏膜(图4F)。重要的是,PDE4B，一种降低细胞内cAMP水平的PDE，在TNF+巨噬细胞中高表达(图4C)。抑制PDE4B抑制骨髓细胞中TNF-a的表达(Komatsu等人，2013;Souza等人，2001年)。我们进行了临床测试可用的PDE抑制剂潘生丁(Gresele et al.， 2011)发现它增加了胞质cAMP水平(图S3B)和抑制脂多糖(LPS)诱导的TNF-a, IL-1b，IL-6在外周血单个核细胞中的表达(pbmc)(图4G和4H)。潘生丁也抑制TNF-a在粒细胞-巨噬细胞集落刺激中的表达因子(GM-CSF)条件的巨噬细胞的反应。
除了IL1B表达增加外，炎性小体、as凋亡相关的斑点样蛋白增加包含一个卡(ASC)斑点(由PYCARD编码)和NLRP3簇的形成，在PIBD中也被激活(图S3C)。风险基因分析显示NFKBIA, AKIRIN2，NFKBIZ (Tartey et al.， 2014)可能会促进异常激活并促进过度炎症(图S3D)。因此，高炎性巨噬细胞和树突状细胞的浸润也是PIBD的一个标志，这个可以通过潘生丁作为PDE的抑制剂来使用。
5 Tissue-Resident Memory B Cells and IgG+ Plasma Cells Are Enriched in PIBD
（组织特异的记忆B细胞以及lgG+的浆细胞在PIBD中富集）
与对照组相比，粘膜的CD19+ B细胞丰度在结肠炎中显著增加，而CD138+浆细胞在典型UC患者和CD患者中明显增多(图5A)。我们确定了7个具有CD19+ B细胞亚群和两个浆细胞亚群(图5B)。三个B细胞亚群表达CD69和CD44，组织特异的基因，这些B细胞亚群被称为组织驻留记忆B细胞(Brm) (Allie et al.， 2019)。KLF2, 介导CD62L(由SELL编码)的表达和免疫细胞经内皮细胞迁移到结肠粘膜(Hart et al.， 2011)，在Brm细胞中高表达，而组织常驻标记物ITGAE (CD103)在原浆细胞中高表达(图5C)。
我们对BCRs的分析显示了显著的克隆扩增在Brm-CD27lo，浆母细胞和浆细胞(图5D)。细胞状态转移分析显示Brm-CD27lo细胞有贡献以IgG1-和IgA1-为主表达浆细胞(图5E)。在IBD受试者中，我们发现IgG1与IgA1的浆细胞比例显著增加了，这与之前的报告CXCR4+IgG+浆细胞促进IBD的发生一致(Buckneret al ., 2014;Uo等，2013)。IBD患者的IgG抗体也显著增加了Igl-to-Igk轻链比率，提示IBD患者的IgGs可能更多与对照组不同(图5F)。PIBD受试者的Brm亚群比较对照组在基因转录方面没有明显差异(数据没有显示)。相比之下，表达igha1的血浆结肠炎和IBD的细胞呈高表达抑制NF-kB活化的基因，包括NFKBIA, TSC22D3 (GILZ) (Jones et al.， 2016)和MALAT1(Zhao et al.， 2016)(图5G)。非规范NF-kB激活对IgA类的转换和表达至关重要(Jin等，2012)。候选PIBD风险基因NFKBIA高表达在IgA+浆细胞中(图5H)
6 CD39+ IETs Display Cytotoxic and Regulatory Signatures and Are Decreased in Abundance in PIBD
（CD39+IETs显示了细胞毒性和调控特征，并且在PIBD中丰度减少）
在T细胞和NK细胞中，有16个细胞亚群(图6A, 6B，和S4A)和特定子集的TFs(图6C和6D)被识别。表达ZNF683和entpd1的CD8组织常驻蛋白记忆细胞(CD8Trm)共享类似的全局基因表达使用表达ZNF683和entpd1的gd的程序分别T细胞。考虑到CD8和gdT细胞有明显的区别可以通过表达来区分的发育起源TCR和CD8基因分别是一种常见的粘膜微环境可能塑造了它们的功能。ENTPD1也会被CD4 Treg和NK T细胞表达，但是在比较中，它们表现出不同的转录程序与ENTPD1+ CD8 Trm和gd T细胞相比(图S4B)。
为了了解他们之间的发展关系，传统的IETs，我们分析了TCR克隆扩增和单元格状态转换(图6E和6F)。对于CD4T细胞，state从幼稚的CD4 T细胞转变为活化的CD4T细胞分化为Treg-、Tfh-、th17类亚群。的th17样亚群扩增无性系数量最多Treg细胞的种类及表现出谱系可塑性;Th17标记基因RORA和CCR6在两个亚群中均有表达结肠粘膜。对于CD8T细胞，克隆扩增主要发生在ITGAE (CD103)表达CD8Trm 子集(CD8-ITGAE和CD8-ENTPD1)和GZMK+effector记忆CD8 T细胞。细胞之间的状态转换最为频繁两个ITGAE+ CD8Trm亚群，表明它们是 发育相关。
T、NK成分差异分析结果显示，CD8-ENTPD1、gdTENTPD1、PIBD中CD8-ITGAE Trm细胞减少与对照组比较(图S4C-S4E)。免疫IETs的表型证实了其丰度的降低结肠黏膜中表达CD8Trm和gdT细胞的cd39在PIBD(图6G, S4F和S5A-S5C)。CD39(编码ENTPD1)是一种膜结合的外切核苷酸酶通过降解过量的细胞外ATP来维持免疫稳态而将ADP转化为AMP. CD39则经常在耗竭性细胞上发现慢性病毒感染和肿瘤患者的T细胞(Canaleet al ., 2018;Gupta等人，2015)，以及FOXP3+ Treg细胞(Borsellino等人，2007年)。然而，在结肠粘膜中，CD8-而gdT-ENTPD1细胞同时表达细胞毒性或效应器(GZMA, GZMB, GNLY, IFNG, CCL5, IL16, IL32，和KLRD1)和免疫抑制(LAG3, LAYN, HAVCR2和TIGIT)的分子(图S4G)，表明它们的住所反对监管网络。
然后我们进行共表达分析，发现GPR65、CD247 (TCR zeta链)、MAP3K8呈阳性与ENTPD1表达式相关联(图S5D)。GPR65IBD风险基因及其I231L变异(rs3742704)是否减少在低pH条件下发生的胞质cAMP浓度在炎症期间(Lassen et al.， 2016)。MAP3K8 (TPL2)调控下游TCR的ERK激活(Tsatsanis等，和TNF-a信号(Eliopoulos等人，2006)。候选人IBD相关的高谱系不平衡的致病变异SNP rs1042058被预测会导致基因的减少MAP3K8表达(Roulis et al.， 2014)。在人类巨噬细胞,CD39转录由ATF2和下游的CREB启动cAMP-PKA-ERK通路(Liao et al.， 2010)。在T细胞，cAMP反应通路广泛相关T细胞活化及随后获得调节功能(Klein and Bopp, 2016;Raker等人，2016)。的比较之间的度ENTPD1 +和ENTPD1 CD8和gdT细胞结果表明，PKA和ERK通路在PKA和ERK通路中富集ENTPD1+子集(图sce)。大部分的比较CD39 + CD8Trm细胞CD39 Trm细胞验证这些发现并进一步揭示了第二信使的中介作用通路调控CD39的表达(图S5F)。我们假设即酸性pH值和过多的TNF-a在患者体内携带IBD风险基因会削弱CREB和ATF2的激活CD39的表达，而PDE抑制剂可以恢复CD39T细胞表达(图6H)。为了验证这个假设，我们激活了在一定条件下从外周血中分离的幼稚CD8 T细胞模拟结肠微环境和炎症。潘生丁显著增加了CD39的表达CD8 T细胞的变化(图6I)。
对风险基因的分析表明CD8-ENTPD1中的抗氧化基因MPST (Nagahara, 2018)与CD8-ITGAE亚群的细胞相比(图S5G)。cAMP信号促进抗氧化反应星形胶质细胞(Paco et al.， 2016)，氧化应激也有贡献对UC发病机制有重要意义(Rana et al.， 2014)。因此,ENTPD1+ CD8和gd T细胞可以发挥额外的保护作用通过维持结肠氧化还原稳态来发挥作用。
我们进一步探讨了CD39表达是否降低可能通过促进ATP和ADP而加重炎症聚集在结肠粘膜。首先,我们相关的T细胞CD39表达与ATP和ADP从结肠释放活组织检查存储在一夜之间。T细胞中CD39表达降低与ADP浓度升高相关(图S5H)。虽然ATP在这些条件下无法检测到，我们表明炎症小体激活在儿童中很常见与PIBD(图S3C)。ADP是一种血小板激动剂5-羟色胺(5-HT)的积累和分泌可以在小鼠中引起药物诱发的过敏反应(Beutier等，2018)。在结肠活组织检查中，我们发现浓度ADP与5-HT呈正相关(图S5H)。此外，从外周血中分离的血小板结肠炎患儿分泌的5-HT较多与对照受试者(图S5I)。Immunofluorescent结肠活检染色显示CD39表达和血小板聚集(通过CD41+簇测定)与对照组和PIBD呈负相关，而PIBD患儿CD41+聚集显著增加(图S5J)。这些数据表明，CD39+ IET缺乏患有PIBD的儿童可能通过以下途径加剧结肠炎症血小板聚集与5-HT释放。
7 Dipyridamole Restores Immune Homeostasis and Alleviates Colitis Symptoms in a Pilot Clinical Study
（潘生丁恢复了免疫稳态并且缓解结肠炎综合征在一个初期的临床研究中）
到目前为止，我们已经证明PIBD的特征是具有超炎性巨噬细胞和树突状细胞。CD39+ IET缺乏症和血小板聚集症，cAMP反应通路可能是潜在的这些缺陷下的一个共同的机制。因此,我们决定用潘生丁在体内靶向这些异常以便改善结肠炎的状态。在葡聚糖硫酸钠中(DSS)诱导的急性结肠炎模型，我们发现结肠小鼠上皮内CD4, CD8和gd T细胞中被加入潘生丁会显著增加了CD39的表达，以剂量补偿的方式(图S6)。与单用DSS治疗的小鼠相比，双嘧达莫治疗效果显著，显著增加体重，结肠长度增加，上皮细胞改善完整性和隐窝结构，血小板聚集减少和TNF-a表达(图7A-7D)。
考虑到潘生丁作为儿童抗血小板药物具有良好的安全记录，可以利用它专门针对小鼠结肠炎的致病机制和缓解进行研究，我们对8例经内镜确诊的结肠炎以及1名IBDU受试者进行了初步的临床研究受试者(表S5)。潘生丁是口服剂量3-5毫克/公斤每天，服用8 -12周。未观察到明显的不良反应。内镜检查评估服用潘生丁前后粘膜愈合情况，临床评分，镜检、组织学严重程度均有显著改善(图7E;表S5)。免疫荧光染色证实潘生丁使CD8和CD4 T细胞，巨噬细胞中CD39表达的升高(图S7A)。激活的ATF2和带有CD39的CREB与观点一致就是增加的cAMP浓度可促进CD39的表达(图7F)。不出所料，潘生丁能显著降低血小板聚集(图7 g)，巨噬细胞浸润和治疗后TNF-a水平也明显下降(图7 h)。
我们也想考虑两种传统的治疗方法(糖皮质激素和抗tnf -a)与它们不同作用方式影响PIBD的免疫表型。因此,我们检查了结肠炎和典型的UC和CD患者接受甲泼尼龙(甲强龙)或抗tnf -a(英夫利昔单抗)治疗(图S7B)。甲强龙治疗明显导致结肠粘膜的血小板聚集减少，但是未改变CD39或TNF-a的表达(图S7C)。甲强龙对血小板聚集的影响，虽然出乎意料，但可以根据之前的文献来解释(Liverani等人，2012年;Moraes等人，2005年)，并支持我们的发现， 以血小板为靶点可能减轻PIBD的临床症状。出乎意料的是，尽管抗tnf -a治疗有所改善结肠的内镜表现(图S7B)，但对恢复巨噬细胞，T细胞，或上文所述的血小板中的多重免疫缺陷没有影响，(图S7C)。一个合理的解释是，抗肿瘤坏死因子- A治疗的目标是TNF-a下游的途径。
总之，我们的发现表明潘生丁可以靶向改善结肠免疫稳态一些免疫缺陷。因此，具有这种在cAMP pathway 具有活性的药物，在儿童/或成人结肠炎或IBD中具有更广泛的应用。
Discussion：
总之，我们提供了在单细胞水平结肠粘膜的转录情况为儿童结肠炎和IBD，并确定可能促进炎症疾病的发展的候选风险基因。这就确定了其发病机制是减少的cAMP-反应通路表现为多重细胞的缺陷。因此，我们对潘生丁（PDE抑制剂具有良好的安全性记录和广泛的可用性）进行了测试。 发现它在小鼠和所有9个患有结肠炎的儿童成功地改善了临床症状。因此，我们提供了一个细胞和分子层面去揭示疾病发病机制和靶向治疗方法的例子。
