准备
1.基因组序列下载与注释，使用prokka进行注释，获得gff文件。
参考我前一篇：
autoprokka:使用prokka批量注释 - 简书 (jianshu.com)
2.roary软件的安装，使用conda/mamba:
mamba install -c bioconda roary
下载gbksplit脚本：
stevenjdunn/gbkSPLIT: Extracts genes using a list of locus tags from .gbk to logically named nucleotide .fasta's. (github.com)
解压备用。
开始
利用roary进行泛基因组分析：
roary gff/*.gff -f roaryoutput/ -e -n -r -p 64
结束以后获得gene_presence_absence.csv文件，打开，根据所用目标菌株的数量，在表格的第四列拉到那个数值的位置后，复制所有该数值对应的目标菌株的其中一个的对应loucus_tag到新建的文本文件中，比如：
保存为locus_tags.txt
之后，找到对应菌株的gbk文件，利用gbksplit脚本去提取所需的目标locus_tag的核酸序列到序列文件中：
gbksplit.py -i /path/to/input/locus_tags.txt -g /path/to/genbank/file.gbk -o /path/to/output_directory/
之后再把序列文件上传到ncbi进行blast筛选，选出特异性最好的一个或者多个，进行后续的验证即可。
补充
提取出来多条序列，单独上传NCBI进行blast比较麻烦，可以把所有fasta文件合并到一条（小于200条合一较好）一次上传NCBI进行blast。
TBtools序列合并
打开TBtools选择序列操作里面的合并与分割：
在左边设置输入文件和输出文件：
按Start开始即可。
多序列blast
打开NCBI blast，选择核酸blast，
选择上传合并的文件开始即可。
