文献

2023

Science Advances

WUSCHEL-RELATED HOMEOBOX 13 suppresses de novo shoot regeneration via cell fate control of pluripotent callus

研究背景

植物具有极强的再生能力，可以从体细胞重建整个个体，其中的关键步骤就是茎尖分生组织（SAM：shoot apical meristem）的重建。 

模式植物拟南芥的组培系统分为两步。首先根或外胚轴作为外植体在CIM上培养以产生愈伤组织，然后转到SIM上，诱导SAM的重建。在CIM培养过程中，生长素通过根分生组织形成途径诱导多能愈伤组织的形成。PLT3、PLT5、PLT7通过上调PLT1/2、CUC1和CUC2在多能性的获得中起关键作用。PLT1、PLT2和WOX5一起诱导TAA1蛋白赋予细胞多能性。转移到SIM后，活化的细胞分裂素直接上调WUS，以促进SAM的形成。WUS是愈伤组织再生芽不可缺少的基因，是芽命运获得的早期标记基因。 

虽然上述调控途径诱导SAM的形成，但植物也有限制愈伤组织再生SAM的负调控机制。几种表观遗传调控维持靶基因位点的抑制状态，从而阻碍细胞命运从愈伤组织向SAM转变。例如，WUS基因座在愈伤组织细胞中具有抑制染色质状态，需要转录激活才能使茎再生。MET1以及PRC2的功能缺失突变导致芽再生增强，这表明消除这些抑制标记有助于SAM的建立。这些正调控和负调控的相互作用共同决定了芽再生效率，然而这些调控在细胞水平决定是否成为SAM还是不清楚的。单细胞测序技术是研究该问题的有效工具。

结论1 WOX13抑制多能愈伤组织新生芽的形成

Fig 1a-c

在之前的研究中，作者发现WOX13是移植后组织修复和器官粘附的关键调节因子。为了测试WOX13在芽再生中的潜在作用，作者使用下胚轴作为外植体，通过两步组织培养系统（Fig 1a）分析了wox13突变体的表型，发现在SIM上培养11天后，wox13突变体有更高的芽丰度（Fig 1b-c）。

Fig 1d

时间序列观察进一步表明，与野生型相比，wox13突变体的茎再生速度加快了3天（Fig 1d）。引入与绿色荧光蛋白(gWOX13-GFP)融合的WOX13基因组片段，补充了wox13突变体的芽再生增强表型，证明wox13抑制新生芽的形成（Fig 1b-c）。

Fig 1e-f

通过细胞学表型观察，发现覆盖在野生型外植体上的高度膨胀的愈伤组织细胞，在wox13突变体外植体中大多缺失，在gWOX13-GFP细胞系中，高度膨胀的球状细胞在愈伤组织中也得以保存（Fig 1e）。wox13突变体的细胞学表型与伤口部位形成的愈伤组织相似，强调了不同愈伤组织类型的细胞学表型的共性。因此，作者推测WOX13限制了愈伤组织再生芽的能力，同时促进细胞分化为高度扩大的球状细胞。

接下来，作者分析了gWOX13-GFP的时空表达模式，发现WOX13在完整的黄化下胚轴中不表达，在CIM孵育后1天内开始表达（Fig 1f），这与之前的研究一致，表明WOX13在切割和生长素处理后被转录诱导。

Fig S2

此外，将外植体放在CIM上和无激素培养基上培养，发现在CIM上培养的外植体中WOX13显著高表达（Fig S2a），这说明更可能是激素而非创伤激活了WOX13。进一步分析发现生长素主要负责上调WOX13在CIM上的表达（Fig S2b）。

在CIM和SIM培养过程中，gWOX13-GFP在愈伤组织细胞群中广泛表达（Fig 1f）。培养10 d后，WOX13在已建立的SAM中完全消失，而在叶片原基中检测到信号。WOX13表达的减少与其在SAM形成中的抑制作用是不一致的。

以上结果表明，WOX13是茎再生的负调控因子，其表达在培养后被诱导上调，并在SAM中局部减少。

结论2 芽分生组织调节因子和细胞壁修饰因子在wox13突变体中异常表达

Fig S3

为了阐明WOX13如何影响愈伤组织形成和芽再生过程中的基因表达谱，作者在组织培养的第0天、CIM上培养4天、SIM上培养4天和SIM上培养7天对野生型和wox13突变体进行了时间序列转录组测序。SIM4时，WT和wox13没有表现出表型差异。在SIM7，wox13建立的SAM非常丰富，而WT很少观察到SAM.

使用edgeR对每个时间点的WT和wox13进行的差异表达分析。在day0时的wox13中有144个基因上调，385个基因下调，GO富集显示主要参与对各种刺激的反应（Fig S3），这些基因可能对外植体准备过程中剧烈的环境变化做出反应，包括切割刺激和从黑暗到光明的转变。虽然目前尚不清楚WOX13是否与再生反应相关，但它似乎参与了广泛的应激反应。

CIM4中差异表达基因数量明显降低，wox13中只有11个基因上调、31个基因下调。转到SIM后，差异表达基因变多。整体转录组分析表明，wox13突变对CIM上形成的愈伤组织没有显著的影响，尽管wox13在SIM上强烈表达，并且在随后的培养过程中错误表达变得明显。

Fig S4

作者比较了多能性获得关键基因的表达情况，发现这些基因大部分在wox13突变体中表现出类似的略高表达趋势（Fig S4a），然而，差异的幅度相当微妙，只有PLT5在wox13突变体中表现出明显更高的表达。正如预期的那样，成像分析没有检测到第4天CIM上pWOX5::ER-GFP(24)表达的任何差异（Fig S4b），进一步表明第4天CIM上愈伤组织中多能性基因的表达没有明显影响。

Fig 2a-b

接下来，作者分析了参与芽命运获得的基因。发现在第4天WUS、CUC1、ESR2、RAP2.6L、PHB、PHV和STM在SIM上的表达水平显著升高，而CUC2和ESR1的表达则根据时间点不受影响或下调（Fig 2a-b）。鉴于这些芽形成调节基因表达的时间比任何可检测到的细胞学差异都要早，因此最有可能的是基因表达变化是wox13突变的直接结果，而不是伴随芽形成表型增强的任何间接结果。

Fig 2c-d

在GO富集中发现了一类与细胞壁松动相关的基因，所以作者还分析了细胞壁相关的基因表达变化。参与细胞壁修饰的基因，如EXPA1 (EXPA1)、EXPA8、EXPA10、EXP11、EXPA14、EXPA15、EXPA17、EXPB3、PME2和MAN7在wox13突变体中显著下调（Fig 2c-d）。之前的研究已经发现，与细胞壁修饰相关的基因与WOX13有关，这支持了WOX13调控细胞壁相关过程的观点。

结论3 WOX13抑制芽分生组织调节因子的表达并诱导细胞壁修饰因子

Fig 3a-b

为了进一步验证wox13突变体中的异常表达基因是否受到WOX13的转录调节，作者使用DEX依赖系统分析了WOX13诱导后候选靶基因的表达。将gWOX13-GR构建物引入到wox13突变体中，首次证实DEX诱导的WOX13-GR蛋白在功能上补充了突变体的表型（Fig 3a-b）。

Fig 3c-d

利用gWOX13-GR细胞系，分析了DEX处理后第3天愈伤组织中候选基因的表达情况。作者发现在wox13突变体中上调的茎部分生组织调节基因，即WUS、STM、ESR2和CUC1，在DEX处理后24小时内下调（Fig 3c）。这一结果支持了WOX13转录抑制这些基因的观点。从wox13突变体的表达数据可以看出，wox13诱导不影响ESR1和CUC2的表达。因此作者假设WOX13特异性地抑制调控芽命运获得的基因子集。

另一方面，作者在诱导后6小时内检测到EXPA17和MAN7的转录上调，在24小时后发现EXPB3的转录显著上调（Fig 3d）。之前报道的ChIP-seq显示，gWOX13-GFP直接结合EXPA17、MAN7和EXPB3位点，表明WOX13通过直接物理结合这些位点，上调了这些细胞壁修饰基因。

综上所述，WOX13转录抑制茎分生组织调节因子的一个特定子集，同时它直接诱导细胞壁修饰基因，这些基因可能参与细胞扩增和细胞分化。

结论4 scRNA-seq揭示了愈伤组织的细胞类群组成

Fig S4a-b

细胞学分析和bulk RNA-seq暗示WOX13可能在SIM培养期间调节愈伤组织细胞群体的细胞命运控制。但是即使在野生型中，SIM培养的愈伤组织的细胞类型了解仍然很少，因此，作者在SIM7d使用了scRNA-seq生成了促进SAM形成的愈伤组织细胞转录图谱。考虑到芽再生的愈伤组织中含有较大的细胞，所以作者采用了基于平板的平台，与通常采用的基于液滴的平台相比，这种平台对细胞大小的限制不那么严格。最终获得了3987个WT与wox13突变体混合的细胞，每个细胞检测到8374个基因。

根据UMAP的聚类，分成了19个典型的cluster（Fig 4a），并根据典型的marker基因对各个cluster进行注释（Fig 4b）。例如，cluster1、9和16对应于茎尖，这些集群中的细胞表现出SAM的marker基因、STM、WUS和CLV3以及包括FIL在内的叶片原抗标记基因的特征性表达。更具体地说，cluster9对应于SAM和叶片原基的表皮细胞层，因为ATML1和LTP6特异性表达。

Fig 4c-d

共聚焦激光扫描显微镜成像证实，在L1层特异性检测到pATML1::NLS:3xEGFP(28)信号（Fig 4c）。

考虑到WUS和CLV1优先表达，而ATML1或FIL几乎不表达，cluster 1似乎由SAM的L3层组成。Cluster 16可能对应于叶片原基细胞的内层，因为这些细胞对WUS和ATML1呈阴性，而对FIL呈阳性（Fig 4a-b）。因此，从cluster9到cluster16的连续区域可能对应于从SAM到叶原基的发育轨迹。

其他cluster可能是由增殖细胞组成的，在scRNA-seq数据中通常观察到，增殖细胞根据其特征基因表达谱组成独立的cluster。S期的marker基因包括HIS4和TSO2主要表达在cluster3和cluster18中，而g2-M期的marker基因如CYCB1;2和CYCA1;1主要表达在cluster11、14和16中（Fig 4a-b）。

虽然能够推断上述部分集群的细胞身份或细胞状态，但时仍有部分集群并不明显。因此，作者生成了marker基因的GFP  reporters，并分析了每个基因的空间表达。形成层的marker基因TDR和ATHB8主要富集在UMAP图的右半部分，主要在愈伤组织的内层中检测到（Fig 4c），这一观察结果表明，UMAP图的右半部分对应于愈伤组织的内层，左半部分对应于愈伤组织的外层。观察到内层和外层细胞的分裂与UMAP图的初级轴一致，表明导致基因表达差异的主要参数是细胞沿内外层轴的位置。

在外层细胞群体或UMAP图的左半部分，位于下半部分的集群对应于上述SAM和新兴叶原基（Fig 4a），而位于上半部分的集群则没有很好地根据所列出的marker基因进行表征。

综上，作者发现整体而言基因表达谱首先被划分为愈伤组织的内层和外层，然后，外层的细胞进一步被划分为SAM和非分生细胞（Fig 4d）。

结论5 在wox13突变体中愈伤组织的细胞组成发生了改变

Fig 5a-b

为了测试wox13突变体是否表现出不同的细胞组成，接下来分别分析了WT和wox13突变体的单细胞转录组数据。在wox13中，cluster1、9和16的细胞高度富集，与观察到的表型一致（Fig 5a）。例如，在wox13突变体中，ATML1表达细胞的比例更高(wox13为10.1%，而WT为1.6%)。我们通过patml1::NLS:3xEGFP成像（Fig 5b）证实，在SIM7d上，wox13突变体中ATML1阳性细胞的丰度更高，尽管在SIM3d上，ATML1表达的差异在较早的时间点并不明显。这与bulk RNA-seq一致，表明在SIM4d中，wox13突变体的ATML1表达不受影响（Fig 2a）。

Fig 5c

Fig S7

接下来，我们使用gWUS-GFP比较了WUS的空间表达模式。正如预期的那样，在SIM7d时的wox13突变体中，作者在SIM上观察到更大的表达WUS的细胞灶。值得注意的是，作者发现在培养早期（SIM3d），wox13突变体中表达WUS的细胞数量更高（Fig 5c），而wox13突变体的愈伤组织形态和通过其投影面积测量的愈伤组织大小都没有受到显著影响（Fig S7a-b）。

WUS转录是由细胞分裂素直接诱导的，所以作者推测细胞分裂素反应在wox13突变体中可能升高。作者比较了细胞分裂素报告基因TCSn::GFP的表达，但是没有发现TCSn::GFP在WT和wox13突变体之间的表达水平和空间格局有任何差异（Fig S7c）。这说明观察到的WUS表达差异更可能是由于WOX13基因调控的主要结果，而不是分生组织形成早期或激素反应改变的间接后果。

Fig 5d

另一方面，作者检测到WT细胞更丰富的细胞类型。EXPA17-positive 细胞的相对比例在WT（4.7%）高于wox13（0.8%）。两种基因型的愈伤组织细胞在SIM3d中表达EXPA17，在SIM7d中表达EXPA17的细胞增加（Fig 5d）。这些观察结果与细胞学分析一致，即在wox13突变体中，高度扩增的球状细胞大部分缺失。总的来说，scRNA-seq的对比分析以及细胞类型marker基因成像显示，WT和wox13突变体之间的差异表达至少部分归因于愈伤组织细胞组成的差异。

结论6 相互抑制的WOX13和WUS决定愈伤组织细胞的身份

Fig 6

上面描述的数据表明，WOX13促进愈伤组织中非分生细胞的命运。之前的研究已经表明，WUS可以调节细胞命运转为SAM。基于此作者推测WOX13和WUS可能是多能愈伤组织细胞群体中二元细胞命运的决定因素。为了探究WOX13与WUS之间的调控关系，作者首先利用mRUBY和GFP分别对WOX13和WUS的时空表达进行了分析。gWOX13-mRUBY信号在愈伤组织中广泛存在，偶有弱表达点，与gWOX13-GFP观察结果一致。

作者观察到gWUS-GFP的表达通常在这些wox13阴性点开始（Fig 6a），另外还观察到在WUS表达早期，gWUS-GFP 3和gWOX13-mRUBY表达重叠的少数情况（Fig 6b）。序列成像分析发现，即使在有限表达的情况下，WOX13和WUS的表达域也逐渐在空间上分离，WOX13完全不存在于原分生组织（Fig 6c）和已建立的SAM中（Fig 6d-e）。

Fig 7a-d

相互排斥的空间表达模式的建立，提出了WOX13和WUS相互抑制的可能性。如前所述，作者发现WUS在wox13突变体中的表达升高（Fig 2b和Fig5c），并且wox13在体内转录抑制WUS（Fig 3c）。作者还使用了荧光素酶报告基因进行了转激活实验，测试了WOX13对WUS启动子活性的调节作用。

如Fig 7a所示，WOX13的过表达显著抑制了拟南芥培养细胞中WUS的促进作用，强调了WOX13负向调节WUS表达的观点。通过transactivation assay，作者测试了WUS对WOX13启动子的转录调控，发现过表达WUS强烈抑制WOX13启动子的活性（Fig 7b）。此外，先前研究中描述的ChIP-seq表明，WUS可以直接结合WOX13位点（Fig 7c）。这些数据共同证明WOX13和WUS相互抑制对方的表达。

为了验证WUS表达上调是否与WOX13突变体的芽再生表型增强有关，作者分析了WUS与wox13之间的遗传互作。发现wus突变完全抑制了wox13的再生能力（Fig 7d）。因此作者认为wus突变对wox13突变的控制是上位性的，这与wox13抑制wus的调控机制是一致的。此外，wox13突变表型的另一个方面，即缺乏高度扩大的球状细胞，并不能通过渗入wox13突变来恢复（Fig 7d），这些观察结果表明，wox13突变体的芽再生表型增强依赖于WUS的抑制，而高度膨胀的球状细胞的形成与WUS无关。

总结

Fig 7e

在这项研究中，作者发现了一个以前未被认识到的调控层，在芽再生中介导细胞命运控制。

与PRC2或MET1等其他已知的茎再生负调控因子不同，WOX13通过促进获得可选择的细胞命运，成为高度膨胀的球状细胞，从而对芽再生效率产生负影响。

WOX13直接诱导EXPs和MAN7的表达，这可能与细胞扩增和细胞分化有关，同时负调控芽组织调节因子，如WUS、STM、ESR2和CUC1。

WOX13与WUS构成了一个相互抑制的调控回路，从而在空间上分离了愈伤组织细胞群体中的微区域（Fig 7e）。

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