一、导读

研究发现，水生植物粉绿狐尾藻（Myriophyllum aquaticum）对水生环境中的高铵（NH₄⁺）具有较强的抗性，且对处理猪废水具有较高的有效性。

为了探究粉绿狐尾藻对NH₄⁺的耐受机制，研究者对粉绿狐尾藻在NH₄⁺胁迫下的转录组学和生理响应进行了研究。在温室中以0.2 mM的NH₄⁺作为对照（N1），在高NH₄⁺（10 mM；N2）和超高NH₄⁺（70 mM；N3）浓度培养条件下对不同样本进行Illumina测序以及PacBio单分子实时测序。其中，**N3植株出现明显的NH₄⁺中毒症状，而N1和N2植株在2周培养处理下仍能够旺盛的生长。

在N2和N3处理下，在绿狐尾藻中共鉴定出31678和35072个差异表达基因：

• 叶片中捕光叶绿素a/b结合蛋白基因的转录上调有助于绿狐尾藻对NH₄⁺的高抗性。
• 过氧化氢酶基因的转录调控可能平衡了高NH₄⁺条件下植物的活性氧。
• 氮代谢基因（包括NH₄⁺转运体、谷氨酰胺合成酶、谷氨酸合成酶、谷氨酸脱氢酶和天冬酰胺合成酶基因）转录的下调或上调在高NH₄⁺浓度下能够通过NH₄⁺摄取、转运和同化在NH₄⁺稳态方面扮演着不可或缺的作用。

本研究为粉绿狐尾藻对NH₄⁺胁迫响应的分子和生理机制提供了见解，本研究的转录组数据有利于未来对该物种的进一步研究。这些结果为粉绿狐尾藻处理猪废水中高强NH₄⁺奠定了理论基础。

原名：Transcriptomic and physiological analysis revealed the ammonium tolerance mechanisms of Myriophyllum aquaticum
译名：转录组结合生理分析揭示了粉绿狐尾藻对铵的耐受机制
期刊：Environmental and Experimental Botany
IF：5.545
发表时间：2021年3月
通讯作者：吴金水，李宝珍
通讯作者单位：中国科学院亚热带农业生态研究所
DOI号：10.1016/j.envexpbot.2021.104462

二、实验设计

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三、结果

1. 粉绿狐尾藻（M. aquaticum）对不同NH₄⁺浓度的形态和生理反应

在不同NH₄⁺处理植株14天时（D14），N1和N2处理组中的植株表现出较强的生长活力（图1A-B），而N3处理组中的植株上出现可见的NH₄⁺中毒症状（叶缘枯萎，图1C）。

N2植株的鲜重（FW）是N1植株的1.16倍，N3处理植株的FW仅为N1处理植株的51.2%；试验结束时研究者在株高上同样观察到相同的趋势（1D-E）。外部NH₄⁺浓度较低时植株根长较长（图1F）。当提高外部NH₄⁺浓度时，能够观察到所有植物组织的NH₄⁺和NO₃^-浓度均有所增强。在相应处理下根中NH₄⁺浓度低于叶和茎中的NH₄⁺的浓度，而N2和N3处理使根中NO₃^-浓度升高的最多（图1G-H）。与此同时，N2植株叶片中Chl a、Chl b和总Chl浓度显著高于对照植株（p＜0.05），分别是对照组的1.15、1.23和1.17倍；N3处理植株叶片中Chl a、Chl b和总Chl浓度最低，分别为对照植株的86.9%、87.4%和87.0%（图1I）。

图1.粉绿狐尾藻（Myriophyllum aquaticum）对不同铵浓度的形态和生理响应

• A-C 分别代表粉绿狐尾藻在水培培养系统中在N1（0.2 mM NH₄⁺）、N2（10 mM NH₄⁺）、N3（70 mM NH₄⁺）处理下生长14天的图片，C中的红圈代表在N3处理下叶缘发生枯萎；
• D-F 分别代表植株鲜重（FW）（D）、株高（E）以及根长（F）；
• G-I 分别代表在叶（G）、茎（H）和根（I）中的NH₄⁺浓度，NO₃^-浓度以及叶绿素浓度。不同字母代表在p＜0.05水平上具有显著性差异。

2. SMRT测序和RNA测序生成的数据

通过SMRT测序共生成53.18 Gb聚合酶阅读碱基（polymerase read bases）（表1）。经过过滤去冗余后，在叶、茎和根中分别获得78262、64046和77012个unigenes。通过对包括NR、NT、Pfam、KOG/COG、Swiss-prot、KEGG和GO在内的7个数据库中进行注释，获得了粉绿狐尾藻基因功能的全面信息。NR数据库中的匹配序列结果显示，与粉绿狐尾藻匹配率较高的前3位物种是葡萄（Vitis vinifera）、核桃（Juglans regia）和可可树（Theobroma cacao），但最高匹配基因不超过30%以上。RNA-seq中共生成1600529958个原始reads。过滤原始数据后，获得1552514922个干净reads，27个样本中所获得的reads范围从43573784到74086926不等。平均数据量为8.62 GB，错误率低于0.03%，Q20高于97.66%，RNA-seq所得高质量数据满足后续分析要求。

表1.PacBio Sequel测序平台生成的原始数据。

3. DEGs的鉴定和KEGG分析

使用N1作为对照，进一步对N2和N3处理的差异表达基因（DEGs）进行分析，分别鉴定出31678和35072个DEGs。在N2和N3处理组中植株 根系 的DEGs数量均最高。除了N3处理组植株的根部样本外，其余样本所检测到的表达上调基因数量均多于表达下调基因数量（图2A）。

Venn图中可以发现有22343个（83.4%）DEGs在N2处理下具有组织特异性，有21343个（76.2%）在N3处理下具有组织特异性（图2B-C）。此外，在N2和N3处理中的叶、茎和根中分别存在1116个、2898个以及8929个共有DEGs，分别占总DEGs的7.2%、18.2%和39.7%（图2D-F）。

图2.粉绿狐尾藻在不同浓度铵培养14 d后，在叶（L）、茎（S）和根（R）中所检测到的DEGs。

其中，N1代表0.2 mM NH₄⁺、N2代表10 mM NH₄⁺，N3代表70 mM NH₄⁺；A代表基因表达数量；B-C分别代表N2 vs N1和N3 vs N1不同组织之间DEGs的Venn图；D-F分别代表在叶（L）、茎（S）和根（R）之间N2 vs N1和N3 vs N1比较所产生的DEGs Venn图。

根据N1、N2和N3处理的基因表达模式，基于STEM软件研究者进一步将这些不同组织样本中的DEGs聚为16个谱系。进一步选择显著聚类（p＜0.05）的基因进行KEGG通路富集分析，其中在叶片组织中选择“control-down-up”模式（谱系10和9）、在茎组织中选择“control-up-up”模式（谱系13、12、8、15），在根组织中选择“control-up-up”模式（谱系15和11）的谱系。通过分析发现，与光合作用相关的途径在叶片中显著富集。光合作用-天线蛋白（ko00196）途径的基因最多，富集因子最大，q值最低。茎中过氧化物酶体（ko04146）途径的q值最低，而根中过氧化物酶体途径的q值为2.87E-19，富集了150个基因。与N代谢启动相关的丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢（ko00250）在茎和根中显著富集（表2），因此猜测这些反应可能在抵抗高NH₄⁺浓度中发挥关键作用。

表2. 差异表达基因（DEGs）的KEGG通路分析。

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4. DEGs调节叶片中的天线蛋白（antenna proteins）

光捕获叶绿素a/b结合（LHC）蛋白又称天线蛋白，能提高光吸收和激发能量转移。LHCA1～LHCA5以及LHCB1～LHCB7是LHC基因家族的成员。与N1处理相比，共有57个LHCAs在N2处理组中被上调，其倍数变化范围在0.9-5.8之间。同时，有98个已鉴定的LHCBs在N3处理下也均上调，其倍数变化范围为0.9-6.9。与对照相比，N3处理组中有31个LHCAs基因和33个LHCBs基因下调，其倍数变化范围分别在1.6-3.0和2.1-8.1之间（表3）。结合N2处理组叶片中叶绿素浓度显著增加，同时N3处理下叶绿素浓度最低（图1I），研究者认为光合作用的调节与粉绿狐尾藻对NH₄⁺的耐受能力和毒性密切相关。

表3.不同铵浓度处理下叶片中差异表达的LHC基因

5. 铵诱导的氧化应激

为研究NH₄⁺胁迫下ROS积累所引起的质膜氧化损伤，采用荧光探针对根中的O₂^·-和H₂O₂进行染色，其中图3A-B中可以发现，N3处理明显增加了植物根部的荧光强度，这表明高NH₄⁺刺激ROS的产生，进而诱导了植株内丙二醛（MDA）和脯氨酸（Pro）的产生（图3C-D）。CAT作为过氧化物酶（ko04146）途径的重要组成部分，在清除积累的ROS中发挥重要的作用。通过分析可以发现，N2和N3处理导致了植株叶片和茎中CAT活性的显著增加（p＜0.05）；受CAT基因调控，N3处理根系中CAT活性是对照组和N2植株的2.90倍（图3E）。此外可以发现，本研究所鉴定出的CAT基因在N2和N3处理条件下，在所有组织中多数均被上调（图3F）。

图3.在不同铵浓度处理下，粉绿狐尾藻根部活性氧（ROS）积累的荧光图像

（A-B），不同组织中丙二醛（MDA）浓度（C）、脯氨酸（Pro）浓度（D）、过氧化氢酶（CAT）活性（E）以及CAT基因的差异表达情况（F）。图中红色荧光代表O₂^·-，绿色荧光代表H₂O₂。

6. 氮代谢对高NH₄⁺浓度的响应

硝酸盐转运体（NRT）基因调节了NO₃^-的吸收和转运，其在对照植株根系中高表达；对于AMT基因而言亦是如此。这些结果表明N1处理促进了粉绿狐尾藻根系对外环境N的吸收。不同的是，本研究所鉴定出的NR和NiR基因在叶片中高表达，这暗示出NO₃^-还原为NH₄⁺多发生在植株叶片中。在叶片中鉴定出的11个GS基因以及在根部鉴定出的17个GS基因均随着外界NH₄⁺浓度的增加而表达下降。同时，GOGAT（Fe）基因在叶片中高表达，GOGAT（NADH）基因在根中高表达，但这些基因大部分在N3处理下下调。这些结果表明，在高NH₄⁺条件下，GS/GOGAT循环的调节变弱。相反，13个GDH基因在N2和N3处理下明显上调，此外，大多数已鉴定的AS基因在N3处理下的叶片中以及在N2和N3处理下的茎和根中上调，这表明GDH和AS基因可能在粉绿狐尾藻高NH₄⁺抗性中发挥至关重要的作用（图4A）。

N3处理组中植株茎和根中GDH活性显著提高（p＜0.05），且分别是N1处理下的1.16和1.46倍（图4B）。N2处理组中植株叶、茎、根中AS活性分别是对照植株的2.03、1.49、1.52倍，而N3处理组中植株叶、茎、根中AS活性分别是对照植株的6.13、6.17、7.84倍（图4C）。作为NH₄⁺同化的主要产物，随着叶片和茎中外界NH₄⁺浓度的增加，Gln浓度显著增加。茎和根中Asn浓度也观察到相同的趋势。N3处理下植株组织中Glu浓度显著高于N1和N2处理组植株，但N1和N2处理组植株之间差异不显著。在各处理内，茎中Gln、Glu、Asn浓度均高于叶和根（图4D-F）。

图4.在不同铵浓度处理下，粉绿狐尾藻氮代谢相关基因的热图分析

（A）、谷氨酸脱氢酶（B）、天冬酰胺合成酶（C）活性变化以及谷氨酰胺（Gln，D）、谷氨酸盐（Glu，E）、天冬酰胺酸（F）浓度在不同组织中的变化情况。图A中的蓝色箭头代表硝酸盐还原过程，绿色箭头代表NH₄⁺摄取和转运过程，黄色箭头代表NH₄⁺同化过程。NRT代表硝酸盐转运蛋白；NR代表硝酸盐还原酶；NiR带包亚硝酸盐还原酶；AMT代表铵转运蛋白；GS代表谷氨酰胺合成酶；GOGAT代表谷氨酸合成酶。

7. qPCR验证

为了验证RNA-seq结果的准确性，研究者选择15个关键基因进行qPCR验证，这些基因包括NRT、NR、NiR、AMT、GS、GOGAT、GDH和AS（图5A）。在叶片中，13个基因的qPCR和RNA-seq之间的相关系数超过0.82，其中8个基因相关系数达到0.99。在茎中，10个基因相关系数超过0.81，其中GDH3032、AS2374、AS2248、NR1952的相关系数达到0.99。在根部，12个基因的相关系数均在0.86以上，其中7个基因的相关系数达到0.99（图5B）。一般而言，qPCR相对基因表达水平的趋势与RNA-seq FPKM结果一致，这表明转录组结果准确可靠。

图5.在不同铵浓度处理下，粉绿狐尾藻植株的根、茎、叶中15个基因qPCR数据结果（A）及其与RNA测序数据之间的相关性（B）。图B中红色代表高度相关，绿色代表相关性较低

四、讨论

1 NH₄⁺对植物生长和基因表达整体变化的影响
若想用高强度的NH₄⁺来处理猪废水，人工湿地（CWs）系统中使用的水生植物需要对高浓度的NH₄⁺具有耐受性。但不同水生植物对NH₄⁺的耐受性不同。当NH₄⁺浓度高于0.1 mM时会降低细叶满江红（Azolla filiculoides）的生长速率，；当外界NH₄⁺浓度超过0.4 mM时，金鱼藻（Ceratophyllum demersum）的生长也会受到影响。在本研究中，粉绿狐尾藻在高达10 mM的NH₄⁺浓度下保持健康生长，但由于70 mM对植株产生了急剧的毒性（生长的抑制、叶片黄化鲜重显著下降和叶缘的枯萎），这使得其不能耐受的70 mM的NH₄⁺。作为NH₄⁺的第一个传感器官，NH₄⁺毒性的初始信号出现在根部，这通常会导致在高NH₄⁺条件下根系结构发生改变（图1F）。

本研究首次基于PacBio Sequel测序从粉绿狐尾藻的叶、茎和根中分别生成了19.14、15.83和18.21 GB的数据集（表1），基于校正分析，本研究数据为全面了解粉绿狐尾藻的遗传信息提供了全面数据。N2和N1、N3和N1之间的DGEs分析表明，与叶或茎组织中的DEGs相比，我们在根中可以观察到更多的DEGs（图2），这表明根似乎响应NH₄⁺增加的第一个传感器官。对成簇上调谱中基因的KEGG通路富集分析显示，光合作用天线蛋白、过氧化物酶体、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢通路最有可能与粉绿狐尾藻的NH₄⁺耐受有关。

2 NH₄⁺调节了光合用反应
在高浓度NH₄⁺条件下，与光合作用相关的途径在粉绿狐尾藻叶片中显著富集（表2），这一现象与15 mM NH₄⁺处理下水稻地上部所注释到的结果相一致。在N2处理下，植株内所有LHCA和LHCB基因均上调（表3）。该反应与在浮萍中观察到的反应不同。在浮萍中，其光合作用天线蛋白（ko00196）仅在外周富集，且随NH₄⁺浓度的升高而下调。此外，水稻在过量NH₄⁺处理下，6个LHC基因严重受到抑制。这些结果上的差异表明，与其他植物物种相比，粉绿狐尾藻在高NH₄⁺条件下具有更大的光捕获能力。

10 mM NH₄⁺处理下粉绿狐尾藻叶绿素浓度高于0.2 mM NH₄⁺处理组（图1I）。先前的研究同样表明，适当的NH₄⁺胁迫会增加拟南芥中的叶绿素浓度。10 mM NH₄⁺供给为粉绿狐尾藻将额外的NH₄⁺同化为氨基酸提供了所需的能量和碳骨架，这对于增强光合作用而言具有益处。已有的研究发现，高浓度NH₄⁺所产生的毒性会引起净光合作用的下降，这与本研究中70 mM NH₄⁺下调了粉绿狐尾藻LHC基因的表达以及叶绿素浓度的降低相一致（表3，图1I）。

3 NH₄⁺诱导氧化应激
茎和根中随 NH₄⁺ 浓度升高所表现出的 control-up-up 表达谱中富集的过氧化物酶体通路显示，高浓度的NH₄⁺诱导了植物中的氧化应激（表2）。N2处理显著提高了粉绿狐尾藻叶片和茎中CAT活性（图3E），此外在苦草（Vallisneria asiatica）和Hydrilla verticillate的研究中同样发现，在高NH₄⁺条件下会增加植株叶片CAT活性。需要注意的是，N2处理组植物根部的CAT活性保持在较低水平。其原因可能是由于与N2处理下的叶和茎相比，根中NH₄⁺积累较低（图1G）。在作者先前的研究中，在10 mM NH₄⁺处理下，SOD和POD的活性较高。而N2处理组ROS积累、MDA和Pro浓度保持在低水平（图3A-D），这可能是由于植物抗氧化酶系统通过清除过量的ROS以减少植物应激的功能所导致。然而，70 mM NH₄⁺胁迫导致所有组织中CAT基因表达和活性升高，与此同时可以发现ROS得到积累，同时MDA和Pro浓度较高（图3）。高浓度NH₄⁺胁迫导致植株体内积累的大量ROS超过其自身的调控范围，进而对植株造成影响，并对光合作用造成损伤，导致该条件下的光抑制。

4 高NH₄⁺影响N的吸收和还原
NH₄⁺吸收过程受到AMT基因的严格调控。以i2_c80919/f1p4/2038（注释到AMT1;2）为代表，在粉绿狐尾藻中鉴定出的大部分AMT基因在N2和N3处理下的根组织中下调（图4A）。NH₄⁺被植物细胞视为信号分子，N2和N3处理下的高NH₄⁺积累诱导AMTs的低表达，这一过程可作为植株体内的负反馈调节，通过降低NH₄⁺的吸收以保持体内NH₄⁺的平衡。在0.2 mM NH₄⁺处理下根组织高表达的AMT基因中，部分在N2处理下在叶片组织中表达上调（图4A）。在N供给条件下，AMT1;1在拟南芥叶片中高表达，其可能在光呼吸过程中将细胞丢失的NH₄⁺转运回叶肉细胞的过程中起到作用。

在本研究中，N1处理下NRT基因在根中的表达最高。有研究发现，AtNRT2.1在N限制条件下对根形态变化方面起重要作用，这恰恰解释了粉绿狐尾藻在0.2 mM NH₄⁺条件下根较长的原因（图1F）。由于粉绿狐尾藻的茎和根中通气组织发育良好，可能粉绿狐尾藻通过分泌氧将营养液中的NO₃^-氧化形成NH₄⁺，这导致了在无NO₃^-的条件下，粉绿狐尾藻组织中NO₃^-浓度随外界NH₄⁺浓度升高而增加。此外，在我们的研究中我们发现，NR基因在叶片中的表达高于根部（图4A），这使得大部分NO₃^-在叶肉细胞中减少，只有一部分在根中减少，导致了在10 mM和70 mM NH₄⁺处理下，植株叶片中NO₃^-浓度是根部的一半。与N1处理相比，N2和N3处理下茎和根中NR基因的表达下调（图4A）。随后，随着NH₄⁺的外部增加，植株中NO₃^-浓度增加（图1H）。其他人先前的研究支持了本研究的结果，其中NH₄⁺补给量的提高能够降低粉绿狐尾藻中NR基因的活性。综上所述，AMT、NRT、NR和NiR基因的下调降低了NH₄⁺的吸收以及NO₃^-的还原，以此避免体内NH₄⁺过多的积累，这可能是粉绿狐尾藻对高NH₄⁺胁迫响应的启动策略。**

5 NH₄⁺同化和氨基酸转运在高NH₄⁺耐受中起重要作用
与NO₃^-浓度相反，植株叶和茎中NH₄⁺浓度显著高于根（图1G）。由于根部吸收的NH₄⁺大量同化为氨基酸，过量的NH₄⁺可以通过木质部运输到地上部。GS/GOGAT循环是植物在正常生长条件下同化NH₄⁺的重要途径。GS1基因以及GOGAT（NADH）基因在根系中高表达，并具有从土壤中吸收NH₄⁺并进行同化的功能，而GS2基因和GOGAT（Fe）基因在叶片中有较高的表达，这些基因可以通过硝酸盐还原和光呼吸产生NH₄⁺；这些基因在N3处理下大部分下调（图4A）。与此相一致的，粉绿狐尾藻中的GS和GOGAT活性在10 mM NH₄⁺浓度下最高，并随着外部NH₄⁺浓度的增加而下降。作为初级NH₄⁺同化产物，粉绿狐尾藻茎中Gln浓度高于叶和根。矛盾的是，GS基因在茎中的表达相对低于叶和根，其原因归因于茎中高Gln浓度是由根中GS同化产生的Gln转运而来。基于转录组学分析显示，当粉绿狐尾藻受超高NH₄⁺胁迫（70 mM NH₄⁺）时，GS和GOGAT变得不那么占优势，NH₄⁺同化的其他途径发挥了更突出的作用。

在N2和N3处理下，研究者在粉绿狐尾藻中鉴定出的GDH基因均上调。茎和根中的GDH活性随着外界NH₄⁺浓度的升高而增加，这与在茎和叶中所观察到的NH₄⁺****浓度变化趋势一致（图1G），并与之前的报道一致：GDH作为一种应激相关酶，当细胞NH₄⁺浓度较高时变得非常活跃。谷氨酸盐（Glu）由2-酮戊二酸和NH₄⁺通过GDH生物合成，同样也可以由GS/GOGAT循环产生。N3处理下粉绿狐尾藻中谷氨酸盐浓度显著高于其他两种处理。由于N3处理植株中GDH表达和GDH活性增加，但GS/GOGAT基因下调（图4A），因此，当NH₄⁺浓度达到70 mM时，GDH似乎在粉绿狐尾藻NH₄⁺的同化中起重要作用。此外，Xian等同样发现GDH在决定水生植物对高NH₄⁺浓度的耐受性方面比GS更重要。

AS被视为是NH₄⁺解毒的关键机制，AS在催化NH₄⁺或Gln形成Asn的生物合成中发挥作用。对粉绿狐尾藻的转录组学分析表明，高NH₄⁺浓度上调了编码AS的unigenes，且在N2和N3处理下其在根部的表达特别高。此外，在其他植物种属中也发现了AS基因的组织特异性表达，如菜豆（Phaseolus vulgari）的PvAS2基因和向日葵（Helianthus annuus）的HaAS1基因在植株根中存在高表达；在紫苜蓿（Medicago sativa）根瘤中，其AS mRNA的丰度显著高于其他组织。与AS基因的表达谱一致，随着外界NH₄⁺浓度的升高，组织中AS活性增强（图4A， C）。而N3处理下植株茎中AS活性高于其他组织，其原因归因于底物NH₄⁺和Gln浓度在茎中也高于其他组织。因此，在相同的处理内，粉绿狐尾藻茎中的Asn浓度显著高于叶和根中的Asn浓度（图4F）。此外，在根系中合成的Asn不仅用于根系的生长，还可以通过木质部转运到地上部。由于Asn的高氮碳比（2：4）以及稳定性，其被视为是N运输和储存的理想分子。

6 假定模型的构建
为了更好地理解粉绿狐尾藻耐受10 mM的NH₄⁺的潜在生物学机制以及10 mM NH₄⁺耐受和70 mM NH₄⁺毒性之间的不同途径，研究者和基于转录组学、酶学和生物化学数据构建了理论模型（图6）。10 mM NH₄ ⁺浓度对大多数菌种而言都具有毒性，但在此条件下粉绿狐尾藻却能够保持良好的生长。在根中，下调的AMT基因作为体内高NH₄⁺的反馈调节有助于避免进一步的NH₄⁺吸收，根部NH₄⁺同化的增加在抵抗高NH₄⁺浓度中起重要作用，即GS/GOGAT、GDH和AS基因的高表达。CAT基因表达的增强用于维持ROS的稳态水平，从而减少对细胞造成的损伤。LHC基因的上调能够使植株捕获并转化更多的光能，为NH₄⁺同化提供了必要的能量和碳骨架。**

当NH₄⁺的环境浓度为70 mM时，其对大多数植物而言都具有毒性和致死性。本研究中，当植物暴露于该浓度下，粉绿狐尾藻根系中的GDH和AS在NH₄⁺同化中起主要作用。与10 mM NH₄⁺下的耐受机制不同，70 mM NH₄⁺下GS/GOGAT循环的作用无论是在根还是在叶中都有所减弱。70 mM NH₄⁺处理也导致茎中同化产物Gln、Glu和Asn的生成，其生成速率显著高于10 mM NH₄⁺处理。同时，ROS在根的累积，结合高表达的CAT基因，高MDA，Pro浓度表明在该浓度下产生了显著的氧化应激。下调的LHC基因降低了光捕获能力，不利于光合作用的进行。尽管粉绿狐尾藻在14天后出现NH₄⁺毒性症状，但植株未死亡（图1A–C）。这些结果进一步证明，粉绿狐尾藻对NH₄⁺具有极高的耐受性。

图6.本研究所假定的粉绿狐尾藻对外部10 mM和70 mM 铵的遗传和生理响应模型

结论
基于PacBio Sequel测序本研究共生成了53.18 GB数据集，为未来粉绿狐尾藻的研究提供遗传信息数据库。基于研究所建立的关键基因的假定模型和热图分析，说明了粉绿狐尾藻对高NH₄⁺浓度的耐受机制和毒害作用。结果表明，光合作用、氧化应激和氮代谢在决定对高浓度NH₄⁺的耐受性中起关键作用。这些发现提高了研究者对粉绿狐尾藻抵抗高环境NH₄⁺浓度的分子和生理机制的认识。此外，本研究的发现为今后在CWs中使用粉绿狐尾藻对高NH₄⁺浓度废水进行生物处理提供了理论基础和指导。

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