用单细胞测序探究了两种生物材料对新冠的治疗机制然后发在Biomaterial（IF: 12.479）上，是个发文新思路哦
1. Immune profiling of COVID-19 ICU patient blood reveals distinct monocyte subsets associated with clinical outcome
流式检测了新冠患者外周血免疫细胞比例。主要分组是给/没给糖皮质激素和恢复/死亡。可以看到，和既往报道一致，不管有没有给激素也不管患者预后，新冠患者都存在淋巴细胞减少和粒细胞增多(A-G)，但CD4和CD8 T, NKT, NK, 嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞比例都没有差别(B-I)。尽管总的单核细胞比例没有变化，但是没有给糖皮质激素的患者中，和恢复的患者相比，死亡的患者CD16-单核细胞 (classical) 比例增加，而CD16+单核细胞(non-classical和intermediate) 比例减少。在给了糖皮质激素的患者中则没有出现这种变化(J-L)。有可能是因为糖皮质激素具有免疫调节功能。
人的外周血单核细胞主要根据CD14和CD16（FCGR3A）的表达来区分:
classical (CD14++CD16-)
non-classical (CD14+CD16++)
intermediate (CD14++CD16+)
参考：单核巨噬细胞
2. Longitudinal profiling of serum and endotracheal aspirate (ETA) from COVID-19 ICU patients reveals elevated levels of DAMPs and PAMPs that potently activate nucleic acid-sensing TLR signaling
此前研究显示，CD16+单核细胞主要参与TLR7/8介导的炎症反应，CD16-单核细胞主要参与TLR4介导的炎症反应1。
Fig 1的结果提示，没有给糖皮质激素的患者的单核亚群出现了变化，所以后面主要对没有给糖皮质激素的患者数据进行了分析。而且由于主要是CD16单核在变化，这两类细胞又对不同的TLR起反应，所以作者下一步分析了新冠患者血浆和气管内抽吸物(ETA)活化不同TLR的能力。
在检测的四个TLR中（TLR3识别双链RNA，TLR7识别单链RNA，TLR4识别LPS/HMGB1等，TLR9识别病毒DNA/线粒体DNA等），所有病人的不同时间点的血浆可以较一致的激活TLR3和TLR7。TLR4和TLR9也有升高，但是不如TLR3和TLR7那么明显。
作者还检测了ETA样品，发现它出现比血浆更为显著的对四种TLR的激活作用（比血浆高3-4倍），提示肺脏局部炎症反应比外周血更重。
HEK-Blue™报告细胞系是一系列从人胚胎肾細胞（HEK293）衍生的细胞系，其设计用于通过监测NF-κB的活化来研究各种PRR信号通路。HEK-Blue™细胞被转染并过表达目标PRR基因，此外，HEKBlue™被转染分泌性胚胎碱性磷酸酶（SEAP）报告基因，由融合了五个NF-κB和AP-1结合位点的最小启动子调控。PRR配体如二酰化脂蛋白和三酰化脂蛋白（分别为TLR2/TLR6、TLR2/TLR1）、胞浆肽聚糖（NOD1/2）或β-葡聚糖（Dectin-1a/b）刺激均可激活NF-κB和AP-1，从而诱导SEAP的产生。使用InvivoGen的QUANTI-Blue™溶液则能够轻易检测SEAP的水平。参考：https://www.invivogen.com/innate-immunity；QUANTI-Blue™ Solution 检测，定量分析碱性磷酸酶
3. Nucleic acid-binding microfibers can deplete DAMPs/PAMPs from COVID-19 ICU patient serum and ETA and limit their ability to stimulate TLRs and induce downstream NFκB activation
因为观测到了新冠ICU患者的外周血和ETA样品都出现很强的活化TLR的能力，TLR又是由DAMPs/PAMP活化的，所以作者下一步探究了Nucleic acid-binding microfibers（核酸结合超细纤维？）对DAMPs/PAMP的清除能力和对外周血TLR活化及其下游NFkB通路的影响
这个纤维就不多做介绍了，知道在之前的研究里它可以清除外周DAMPs就可以了。毕竟这篇发在Biomaterials上，主要就是做材料的
可以看到给了Fiber组的血浆和ETA，活化TLR3, 4, 7, 9的能力都显著下降(A-H)，这个纤维过滤之后的患者血浆和ETA，DNA, RNA, HMGB-1和nucleosomes都显著下降(I-P)。
因为这个fiber具有蛋白滤过功能，作者也查看了它对血浆正常蛋白albumin的影响，发现影响相对较小(Q-R)，提示它安全性较好。
4. Single-cell RNA sequencing of COVID-19 patient monocytes reveals phenotypic differences and DAMP/PAMP response patterns specific for clinical outcome
为了进一步探究不同结局的COVID-19 ICU患者，作者取了新冠患者外周血单核细胞（根据预后分为去世和恢复），体外给了media (control)、LPS (TLR4激动剂，PAMP激活的阳性对照)、R848 (TLR7/8激动剂，模拟患者肺脏和外周血中存在的TLR7/8 agonist）处理后进行了单细胞测序。
Fig 4A-B：三组单核细胞的umap图和六组（前面三组区分了CD16+和CD16-）的样品死亡/恢复的患者这两组的PCA图。可以看到，在media处理组死亡/恢复的CD16+和CD16-细胞是分不开的，在给了LPS/R848之后就独立聚成团，提示不同结局新冠患者单核细胞的功能差异参与了TLR介导的抗病毒免疫失调（？略牵强，这个分面umap图也有点奇怪）。
Fig 4C：上：在对照组(media处理)的CD16-单核在去世和恢复组之间没有差异基因。相反，去世患者的CD16+单核细胞的转录profile与hyper-inflammatory activation相一致，出现了IL1A，IFI27和TNFAIP6等基因的升高。恢复患者则有更高的适应性免疫基因的表达，比如HLA-DRB5（❗️之前很多文献报道新冠患者外周血单核细胞出现HLA下调，这个上调是相对去世患者的单核表达较高）。中图和下图则是分别比较了LPS和R848处理的CD16-和CD16+细胞在去世和恢复患者间的差异基因。整体来看，CD16+单核细胞的差异基因还是要多很多。
Fig 4D：差异基因富集结果
This observation supports the hypothesis that CD16+ monocytes are key regulators of COVID-19 immunopathology and harbor biomarkers associated with clinical outcomes.
Fig 4E F：差异基因的UpSetR，可以明显看到CD16+单核细胞的差异基因更多
分离自去世患者的单核细胞，给TLR激动剂处理后显示出和monocyte tolerance相一致的转录表型。单核细胞由长时间接触大量免疫介质可以引起monocyte tolerance。在前面的数据中可以看到去世患者的CD16+ monocytes不管是给了media还是TLR激动剂都出现了相似水平的S100A8/A9(circulating calprotectin)和SIGLEC9高表达。此前文献报道SIGLEC9可以通过CCR7调节LPS介导的耐受2-4。这个现象在恢复了的患者中则没有观察到。
为了进一步探究这个现象，作者使用了非负矩阵分解鉴定了和临床预后相关的基因表达模式。
Fig 5A：恢复患者的未经TLR激动剂处理的CD16+ monocytes特征性表达pattern 3 (Immune tolerance signatures/CoGAPS pattern) ，而去世患者未经TLR激动剂处理的CD16+ monocytes有一个sub-population低表达pattern 3，提示这个亚群的细胞缺乏功能活性，而恢复患者的细胞则有competent免疫反应。
Fig 5B C：pattern 3 score >0.5的CD16+单核与其它所有CD16+单核比较的差异基因和富集结果。
Fig 5D-F：LPS处理组
Fig 5G-I：R848处理组
5. Monocyte gene network analyses distinguish TLR activation responses associated with ICU patient outcome
转录因子分析，根据前面的结果，作者着重关注了CD16+单核
Fig 6A-C：media处理的恢复患者CD16+单核富集到EGR3和JUND regulon（激活AP-1转录因子，调节抗病毒免疫），LPS和R848处理的恢复患者CD16+单核都富集到STAT1, STAT2和STAT4 regulon (STAT蛋白可以通过诱导干扰素表达限制病毒感染)。但是R848处理的恢复患者CD16+单核CEBPB和ATF4 regulon活性降低。The induction of ATF4 activity by TLR4 signaling interacts with CEBPB to regulate the production of inflammatory cytokines including IL-6, IL-8, and TNF-α。
Fig 6D-F：NFkB是最经典的促炎通路，结果显示死亡患者的单核细胞media处理状态下就存在一定活化。给了LPS/R848之后，恢复患者CD16+单核出现显著的NFkB活化，死亡患者则没有明显变化。
Fig 6G-I：与前面的结果一致，作者发现死亡患者的CD16+单核中NFκB inhibitor--NFKBIA和JUND的表达量呈负相关。在baseline，恢复患者单核细胞表达高水平JUND(A)，而死亡患者单核细胞则表达高水平NFKBIA。LPS/R848刺激后，恢复患者的CD16+单核表达NFKBIA和JUND，死亡患者则没有共表达，提示JUND表达是过度刺激NFκB信号通路的一种补偿反应。
Taken together with our DAMP/PAMP profiling studies, these results suggest that the high levels of nucleic acid-containing DAMPs/PAMPs present in patients may lead to immune tolerance in ICU patients that succumb to COVID-19.
6. Longitudinal proteomics reveals markers of heightened myeloid activation and consumption of PAMP carrier proteins in deceased patients
前面的结论都是转录组的，为了从蛋白水平验证前面的结论， 作者对四个恢复患者和四个死亡患者的血浆进行了蛋白组学检测（包含不同时间点）。
Fig 7A-B：死亡患者和恢复患者相比，上调的蛋白和通路的clustering。提示死亡患者存在髓系通路的高度活化
Fig 7C：免疫相关的差异表达基因热图。去世患者有更高水平的活化中性粒分泌的蛋白，包括NGAL, PRTN3, MMP9, MPO, TRFL和DEF1。这些中性粒分泌的蛋白主要是应对病原诱导的感染下由TLR信号通路介导。去世患者血浆中S100蛋白也更高，它们是炎症反应的marker，参与TLR4表达的正反馈。恢复患者的高表达蛋白包括MARCO，一个巨噬细胞表达的清道夫受体 ，可以与循环PAMPs结合，活化TLR信号通路。这提示去世患者循环的PAMP结合和递送到TLR在消耗MARCO。一些载脂蛋白apolipoproteins包括APOA1, APOA2, APOH, APOD和APOC4同样是在恢复患者血浆中比较高。载脂蛋白可以作为PAMPs的载体活化TLR信号通路，介导抗病毒免疫。死亡患者外周血较低的MARCO和载脂蛋白水平与前面数据中转录水平较高的TLR活化相一致，提示存在着这些蛋白的大量consuming。
Collectively, the COVID-19 ICU patient DAMP/PAMP TLR reporter cell activation studies, single-cell RNA sequencing, and proteomics analyses indicate that TLR hyperstimulation by nucleic acid-containing DAMPs/PAMPs can lead to excessive monocyte activation and con- sumption of immune modulators, all of which are associated with poor outcomes for COVID-19 ICU patients.
7. MnO-based nanoparticles mitigate TLR stimulation by COVID-19 ICU patient serum and ETA, and prevent DAMP/PAMP-mediated induction of TLR tolerance in monocytes
最后作者探究了DAMP/PAMP nanoscavenger是否可以限制这种单核细胞TLR过度活化和TLR耐受。
Fig3的结果提示核酸结合微纤维可以捕获和中和DAMPs/PAMPs，所以作者想要去探究是否有一种可溶性纳米颗粒可以拮抗新冠患者样品中的DAMPs/PAMPs。用了MnO nanoparticles，结果显示有效。（换了另一种生物材料...有凑图嫌疑）
参考文献：
- Human CD14dim monocytes patrol and sense nucleic acids and viruses via TLR7 and TLR8 receptors, Immunity 33 (3) (2010) 375–386.
- Circulating calprotectin as a biomarker of COVID-19 severity, Expet Rev. Clin. Immunol. 17 (5) (2021) 431–443.
- CCR7 and its ligands: balancing immunity and tolerance, Nat. Rev. Immunol. 8 (5) (2008) 362–371.
- Constitutively expressed Siglec-9 inhibits LPS-induced CCR7, but enhances IL-4-induced CD200R expression in human macrophages, Biosci. Biotechnol. Biochem. 80 (6) (2016) 1141–1148.
