Loading buffer即常用的电泳上样缓冲液,工作浓度是1X 。由于点样孔容量有限,所以如果你样品浓度过高可以用低倍数,样品浓度低就用高倍数,以便load更多的样品。
1.核酸电泳中loading buffer的作用:
(1)指示作用:内含剂溴酚蓝和二甲苯氰,显示电泳的进程,以便适时终止电泳;
a. 溴酚蓝:前面的紫蓝色条带,在0.6%、1%、1.4%和2%琼脂糖凝胶电泳中,溴酚兰的迁移率分别与1Kb、0.6Kb、0.2Kb和0.15Kb的双链线性DNA片段大致相同;
b. 二甲苯氰:后面的蓝色条带,它在1%和1.4%琼脂糖中电泳时,其迁移速率分别与2Kb和1.6Kb的双链线性DNA大致相似;
(2)沉降样品:成分甘油可以加大样品密度,使沉到点样孔中防止样品飘出;
(3)变性聚合酶:SDS主要是促使聚合酶变性,避免其结合在DNA双链上影响迁移速率。
2.蛋白电泳中,蛋白样品在定量完毕,经过loading煮完后,可以相对稳定保存,loading buffer在蛋白电泳中的作用:
(1)溴酚蓝指示电泳位置、使样品沉入点样孔;
(2)内含还原剂破坏二硫键,而不会破坏蛋白质的一级结构,不影响WB检测,因为WB主要只是测蛋白表达量,而不需要蛋白的高级结构;
(3)使SDS与蛋白按比例结合,使蛋白表面均匀带上负电荷(具体原理参考https://www.jianshu.com/p/1d1358ed6bf9 里面的SDS lysis buffer部分);
(4)煮沸使蛋白酶失活,中止酶促反应,防止提取的蛋白质降解;
(5)煮沸使DNA充分打断变性;