Article title：UPLC-MS metabolomics provides insights into the differences between black- and white-shelled Pacific oysters Crassostrea gigas
期刊：Journal of Oceanology and Limnology
发表时间：2021
通讯作者：王晓通
超高效液相色谱串联质谱（Ultra Performance Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry,UPLC-MS/MS）
摘要
软体动物中多种多样的壳色具有非常重要的生态和经济价值。太平洋牡蛎具有非常高的营养价值，因而在全世界的海域广泛的养殖。在这个研究中，作者比较了黑色壳牡蛎和白色壳牡蛎在全部的软体以及外套膜组织中黑色素含量的差异。生理指标的结果显示黑色壳牡蛎相较于白色壳牡蛎含有更多的黑色素，更多的干物质，更多的粗脂肪含量以及更强的清除自由基的能力。甘油磷脂，脂肪酰和类固醇（glycerophospholipids, fatty acyls, and steroids）等代谢物的差异揭示了脂类不同的调节机制。相应的代谢组学分析以及先前发布的RNAseq的数据显示黑色壳牡蛎和白色壳牡蛎主要在基础代谢过程中存在差异，例如脂类、氨基酸和嘌呤等的代谢。这项研究主要针对于不同黑色素含量的牡蛎的生理指标和代谢物的差异研究。
前言
贝壳颜色在双壳贝类中可以为贝类本身提供一定的保护，例如利用伪装保护来抵御捕食者等，并且一些贝壳色素还被证明具有抗菌的性能。在自然界中，牡蛎具有丰富的壳色多样性，太平洋牡蛎Crassostrea gigas通过选育获得了具有黑色、白色和其他贝壳颜色的品种。 先前的研究认为壳色是受 遗传因素影响的。通过对不同壳色的家系的研究人们对贝壳颜色的遗传基础已经有了一定的研究，然而这种色素沉着对软体动物的影响却很少被研究。
黑色素是自然界分布最广泛的生物色素，一般呈现棕色或者是黑色，广泛存在于动植物中。它属于不溶于水、酸以及有机溶剂的生物大分子。黑色素可以调控大范围内的分子互作和代谢过程。它具有抗氧化剂以及清除自由基的活性，因而在光保护以及免疫调节中发挥了关键的作用。因此黑色素广泛的应用于食品加工、化妆品开发以及疾病预防和治疗中。
先前的研究已经建立了从太平洋牡蛎中提取黑色素的方法，并且证实了太平洋牡蛎的壳色与黑色素的含量存在显著相关性。一项之前的转录组数据分析结果显示与白壳牡蛎相比含有较高黑色素含量的黑壳牡蛎的外套膜显示出来更强的抗氧化以及自由基清除的能力。这两种牡蛎在免疫策略方面可能存在一定的差异。在这项研究中，作者将基于代谢组的UPLC-MS研究与相应的转录组分析结合，尝试鉴定这两种牡蛎在生物化学成分、抗氧化活性和代谢物方面的差异。
结果
一、生物化学成分和抗氧化活性的比较
黑壳牡蛎中的黑色素含量为白壳牡蛎的1.8倍，黑色素的含量在这两种牡蛎中有显著的差异。黑壳牡蛎的干物质以及粗脂肪的含量分别是白壳牡蛎的1.3倍和1.7倍。然而，在粗蛋白、灰分、糖原含量以及湿重等方面没有显著差异。下图描述了黑壳牡蛎与白壳牡蛎的外套膜组织在抗氧化活性指标方面的差异比较（RP、ILAO以及DPPH这三个指标是存在显著差异的）。
二、代谢组比较
作者在这个研究中是进行了非靶代谢实验。在黑壳牡蛎与白壳牡蛎的比较中通过分析作者一共获得了141个差异代谢物，其中在黑壳牡蛎中有72个表达下调，69个表达上调。这些差异代谢物主要可以分为6类，甘油磷脂、脂肪酰、氨基酸、类固醇（glycerophospholipids, fatty acyls, amino acids,steroids），其他和未分类的，其中甘油磷脂是占主要地位的。关于差异代谢物的KEGG富集通路分析结果如下图：
三、代谢组学和转录组学的相关性分析
通过分析作者发现相关的基因和代谢物主要涉及到脂类、氨基酸和嘌呤代谢途径等。 The lipid metabolism mainly involves the metabolism of glycerophospholipid, arachidonic acid, linoleic acid, andα-linolenic acid. The amino acid metabolism mainly involves the metabolism of glycine, serine, threonine, histidine, tyrosine, tryptophan, and glutathione.
讨论
一、黑壳牡蛎中有更多的黑色素、干物质、粗脂肪含量以及更强的自由基清除能力
黑壳牡蛎中的干物质以及粗脂肪含量更高表明其潜在的经济价值，尽管黑壳牡蛎中的粗脂肪含量要显著高于白壳牡蛎，但是仍然要低于鱼以及一些陆生动物（ terrestrial animals）。作者的研究结果显示黑壳牡蛎的外套膜组织具有更强的清除自由基的能力，特别是SAR和DPPH的活性要显著高于白壳牡蛎。因为自由基对机体是有害的，因此黑壳牡蛎中的黑色素可能在光热条件下能对基体起到一定的保护作用，进而提高牡蛎的环境适应性。
二、黑壳牡蛎和白壳牡蛎中脂质代谢物的差异
研究结果显示在黑壳牡蛎和白壳牡蛎的比较分析中脂类含量是存在显著差异的，这也表明膜脂质的结构和组成在黑壳牡蛎和白壳牡蛎中存在显著差异，这可能导致在很多的生物学过程中产生不同的调节机制。
在双壳贝类中，脂质在维持细胞、组织以及基体正常的功能中是一种关键的组分。The composition and alteration of metabolites between BSO and WSO suggest that there are certain differences in the cell membrane lipids, such as glycerophospholipids, sterols, and sphingolipids, which may lead to different regulatory mechanismsfor a wide spectrum of biological functions, such as activating cells, maintaining the balance of metabolism and hormone secretion, and enhancing immunity 。
三、代谢组和转录组的相关性分析
代谢组和转录组的相关性分析所得到的差异代谢物和差异表达基因进一步表明了在ABC转运途径以及自噬（autophagy）途径的富集。有研究表明黑色素沉着（melanocores）细胞通过吞噬作用（phagocytosis）被角质形成细胞（keratinocytes）内吞（internalized），因此作者认为黑壳牡蛎和白壳牡蛎之间自噬的变化可能与黑壳牡蛎中黑色素生成以及黑色素转运过程的活性有关。尽管黑壳牡蛎和白壳牡蛎之间的色素沉积存在很大的差异，但是由于相关数据库的缺少以及功能注释的缺乏导致并没有关联到与黑色素沉积相关的代谢物。
