本期解读
iTRAQ-based quantitative proteomic reveals proteomic changes in Serratia sp. CM01 and mechanism of Cr(Ⅵ) resistance
发表杂志：Ecotoxicology and Environmental Safety
发表日期：2021.11.22
影响因子：6.291
技术：iTRAQ蛋白质组学技术
研究背景
Cr (Ⅵ)是世界范围内常用的重金属，处理Cr(Ⅵ)污染最有效的方法是将Cr(Ⅵ)转化为Cr(III)。许多微生物具有还原Cr(Ⅵ)的能力，然而，降Cr(Ⅵ)微生物的开发仍停留在筛选、分离、鉴定等表面阶段，这些细菌在Cr(Ⅵ)胁迫下的反应机制尚不清楚。Serratia sp. CM01是一株具有抗Cr和还原能力的野生菌株，这篇文章通过iTRAQ蛋白质组学技术和一系列验证实验阐明了CM01耐Cr(Ⅵ)或降低Cr的可能存在的机制。
技术路线
01 野生型菌株和驯化菌株分别在无Cr和含Cr中培养
02 iTRAQ定量蛋白质组学探讨分子机制
03 差异蛋白系统分析
04 RT-PCR（基因水平验证）
05 疏水性和自聚焦性、葡萄糖含量和总SOD活性（表观验证）
06 分子机制讨论
研究结果
1、差异表达蛋白质的鉴定、功能注释和富集分析
首先作者通过iTRAQ蛋白质组学技术，在WT CM01和驯化的CM01总共鉴定到2750个蛋白，其中646个蛋白有显著差异表达，上调蛋白343个，下调蛋白303个。研究通过注释到涉及氧化还原酶、能量代谢、磷酸肌醇代谢、磷酸戊糖途径等系统中筛选出上调（下表1）和下调（下表2）与Cr(VI)还原和耐受相关的关键蛋白。
对646种差异表达蛋白进行GO功能分类，一些与代谢过程、细胞过程、细胞部分、细胞、催化活性、结合等功能有关的重要蛋白质在驯化的CM01显著上调（下图1）。通过KEGG分类对这些蛋白的相关代谢组学途径进行分析，在上调和下调的差异蛋白中，有四种功能注释相同的途径，分别是“代谢途径”、“次生代谢产物的生物合成”、“不同环境下的微生物代谢”和“ABC转运体”，其中涉及“在不同环境中微生物代谢”的蛋白主要是下调蛋白，这表明它可能在驯化的CM01对Cr(Ⅵ)胁迫的抗性中发挥重要作用（下图2）。
KEGG通路富集分析显示不同功能通路下差异显著的蛋白分布，其中代谢通路、糖酵解/糖异生、磷酸戊糖途径和肌醇磷酸盐代谢均显著富集（下图3）。
Table 1. Cr(VI)还原和耐受相关的上调蛋白
Table 2. Cr(VI)还原和耐受相关的下调蛋白
Figure 1.差异蛋白的功能进行注释
Figure 2.差异蛋白通路注释结果统计图
Figure 3.差异蛋白通路富集分析显著性统计图
接下来作者通过分析Cr(Ⅵ)-胁迫相关蛋白的表达和功能注释, 根据CM01蛋白差异表达结果，选取7个可能在Cr(Ⅵ)还原和耐受中发挥重要作用的蛋白做验证实验。（铁蛋白（ftnA）能够增强机体耐受性，双功能多粘菌素抵抗蛋白（ArnA）在细胞的渗透屏障起关键作用，硫酸盐饥饿诱导蛋白（fliY_1）参与调控微生物的重金属抗性，谷氧还蛋白家族（grxA）在免受氧化损伤方面起着十分重要的作用，黄素氧还蛋白（fldA）是广泛存在于原核生物中的一类重要的电子传递载体，与防氧保护系统有关，硫氧还蛋白（trxA）在缺氧相应条件下起着调节作用，这些蛋白先前被报道参与了微生物的氧化应激反应。氧化还原酶（DX900_04235）也与微生物的氧化应激反应有关）。
2、基因水平的验证
作者进一步通过RT-qPCR进一步验证了蛋白质组学实验的质量。采用RT-qPCR方法验证ftnA，grxA，ArnA，fldA，trxA，fliY_1，DX900_04235共7个功能基因的表达水平并以gyrB的mRNA水平作为内参（下表3），RT-qPCR结果显示，驯化CM01中7个基因的表达水平与iTRAQ蛋白质组学结果一致（下图4）。
Table 3. 所有目标基因的序列特异性引物
Figure 4. 通过RT-qPCR检测WT CM01和驯化CM01中7个基因的表达
3、表观实验的验证
作者根据iTRAQ蛋白质组学技术的分析结果进一步提出了猜想：(a) 差异蛋白中有许多蛋白与氨基酸代谢有关，驯化的CM01中负责编码疏水氨基酸的蛋白表达增加，促进了细菌对渗透胁迫的耐受性，这可能是CM01减少接触Cr(Ⅵ)造成的细胞损伤的一种策略。（b）差异蛋白中有许多蛋白与碳水化合物代谢有关，反映了Cr(Ⅵ)对CM01碳水化合物代谢的抑制(Ⅵ)，导致驯化CM01经Cr(Ⅵ)处理后的葡萄糖含量高于未经Cr(Ⅵ)处理的CM01。(c) 许多与氧化还原和一般应激相关的蛋白都有不同程度的上调或下调，SOD通过破坏对生物系统有害的自由基，增强细菌在不利环境中的耐受性和适应性。Mn/Fe SOD显著上调，这可能是CM01抗氧化Cr(Ⅵ)以适应高Cr(Ⅵ)环境的一种表现。显著下调Cu/Zn SOD，增强宿主防御功能，降低重金属对微生物的毒性。
为了验证上述猜想，作者分别设计了如下三个实验进行进一步验证。
3.1细胞表面疏水性和自聚集性实验
细胞表面疏水性和自聚集性与粘附特性密切相关用Cr(Ⅵ)处理培养的驯化CM01的细胞表面疏水性和自聚集显着高于未用Cr(Ⅵ)处理的那些（下图5）。此外，革兰氏染色中，未加Cr(Ⅵ)处理的细胞分布均匀而加Cr(Ⅵ)处理的细胞在玻片上聚集在一起（下图6）。
3.2细胞内葡萄糖含量测定实验
经Cr(Ⅵ)处理的驯化CM01细胞内葡萄糖含量高于未经Cr(Ⅵ)处理的CM01细胞内葡萄糖含量（下图7）。
3.3总SOD活性测定实验
经Cr(Ⅵ)处理驯化的CM01的总SOD活性高于未经Cr(Ⅵ)处理的CM01，这与iTRAQ蛋白质组学技术结果中SOD蛋白表达上调相一致。外源Cr的浓度对CM01的总SOD活性有影响，当Cr(Ⅵ)浓度小于60 mg/L时，细胞总SOD活性随Cr(Ⅵ)浓度的增加而逐渐升高，当外源Cr(Ⅵ)浓度高于60 mg/L时，细胞总SOD活性降低（下图8）
三个表观实验结果表明，CM01可以通过自聚集形成稳定的生物膜，并与表面增强的疏水氨基酸结合，将重金属从细胞表面分离出来，最终避免Cr(Ⅵ)的毒性效应。在Cr(Ⅵ)作用下，CM01分解葡萄糖的能力降低，导致细胞内葡萄糖积累。SOD通过破坏对生物系统有害的自由基，增强细菌在不利环境中的耐受性和适应性。可见，CM01对重金属的抗性是多种胁迫蛋白共同作用的结果
此外，iTRAQ蛋白质组学技术结果还显示，参与肌醇磷酸盐代谢通路的关键酶上调，说明CM01具有完整的肌醇代谢系统,肌醇磷酸盐的分解代谢可能涉及氧化和磷酸化等生物学过程，以维持正常生长，应对不利环境。参与UvrABC系统的三个蛋白均上调，UvrABC系统在修复逆境胁迫引起的菌株DNA损伤中发挥了重要作用。在上调的蛋白中还发现了一种ATP依赖性的Lon蛋白酶，对于细菌的正常生长、对各种应激反应和抗生素的抵抗以及细菌的毒性都是必不可少的。孔蛋白OmpC参与了大肠杆菌的高渗透胁迫过程，基因ompC编码的两个孔蛋白表达同时上调和下调，产生的这种矛盾将进一步探究。
文章小结
作者基于iTRAQ蛋白质组学技术揭示了驯化的CM01在Cr(VI)存在下的蛋白质组学变化，RT-qPCR实验在基因水平验证了从iTRAQ结果中筛选出7个可能在Cr(Ⅵ)还原和耐受中发挥重要作用的蛋白，测定细胞表面疏水性和自聚集性实验、细胞内葡萄糖含量测定实验、总超氧化物歧化酶(SOD)活性测定实验等结果显示了驯化后的CM01具有复杂的耐受Cr的生物网络(Ⅵ)，这可能与以下几个方面有关: (a) CM01通过抑制碳水化合物的代谢来减少葡萄糖的消耗，是一种节能的生存模式。(b) 肌醇磷酸盐代谢途径起重要作用，可能在耐药Cr中起重要作用。(c) Cr胁迫下CM01蛋白有上调和下调，不同功能的氧化应激蛋白的过表达和抑制增强了菌株在高Cr(Ⅵ)环境中的适应性。(d) CM01增强疏水氨基酸的生物合成以抵抗Cr(Ⅵ)。(e) 一些关键的系统和蛋白，如UvrABC系统、Lon蛋白酶、孔蛋白OmpC等也可能通过修复DNA损伤、改变细菌自聚集、控制膜蛋白通道等途径参与CM01的适应机制。综上所述，这项研究表明了CM01在Cr(Ⅵ)胁迫下能够存活是多种机制的综合结果，为细菌在环境Cr(Ⅵ)胁迫下的潜在机制提供了新的线索。
小编心得：这篇文章是一篇利用iTRAQ蛋白质组学定量技术，对微生物机制研究的经典文章，可供相关领域参考。
