本文主要介绍美国斯坦福大学丛乐课题组在《Nature Cell Biology》杂志上发表的《dCas9-based gene editing for cleavage-free genomic knock-in of long sequences》论文，该文章介绍了一种新型的基因编辑工具—dCas9-SSAP。

基因编辑是基因组和细胞工程的强大工具。以CRISPR–Cas为例，基因编辑可能导致DNA损伤并触发DNA修复过程，而这些过程往往容易出错。当改变长序列时，这种不想要的突变和安全问题可能会更加严重。作者将微生物单链退火蛋白（SSAP）与无催化活性的dCas9偶联用于基因编辑。这种无切割的基因编辑器dCas9–SSAP促进哺乳动物细胞中长序列的敲入。dCas9–SSAP编辑器具有较低误差和最小的偏离，显示出比出传统Cas9方法更高的准确性。它对插入数量级为千的碱基规模的序列是有效的，效率高达约20%。作者进一步对其进行了截短和适体改造，以最大限度地减小其大小，以适应未来应用的单个腺相关病毒载体。总之，这一工具为更安全的长序列基因组编辑提供了一种方法。

图1 Schematic model of the dCas9–SSAP editor

一、提出假设：SSAP可能不依赖于DNA切割，并不具有ATP依赖性

大多数能够长序列敲入的基于CRISPR的编辑器需要单链缺口或DSB，这可以触发容易出错的NHEJ途径，从而导致可变的效率和准确性。相反，噬菌体通过重组系统将自身整合到宿主细菌中，例如λRed。这种精确的噬菌体整合依赖于同源性导向的具体过程是：由SSAP刺激的基因组和供体DNA之间的重组，即lambda Bet或其同源物RecT。根据之前的研究，作者推断噬菌体SSAP可能不依赖于DNA切割，因为其活性很不寻常，并不具有ATP依赖性，与哺乳动物细胞中的ATP依赖性RAD51形成对比。当多个SSAP通过RNA引导的dCas9募集到基因组靶点时，SSAP对单链和双链DNA的高亲和力可能允许附着到供体上。然后，它可以在不切割的情况下促进DNA置换，因为在dCas9介导的DNA解链和R环形成过程中，DNA链变得可瞬时进入。

基于这一假设，作者设计了一个系统，将SSAP招募到催化失活的dCas9中（图1）。dCas9蛋白不能切割DNA，但保留了解开靶位点并形成R环的能力，使非靶链被认为可用于SSAP刺激的同源重组。为了测试这一点，作者设计并评估了三种主要的微生物SSAP：λ噬菌体Bet、大肠杆菌Rac原噬菌体RecT和噬菌体T7 gp2.5。作者通过RNA适体MS2将SSAP募集到化脓性链球菌Cas9的失活版本-dSpCas9（以下简化为dCas9）中（图2）。

图2 Construct designs for screening the gene-editing efficiency of SSAPs using a genomic knock-in assay with an 800-bp 2A–mKate transgene. NLS, nuclear localization sequence.

将该MS2适体插入单一引导RNA（sgRNA）支架中，并将候选SSAP与特异性结合MS2适配体的C末端MS2外壳蛋白（MCP）融合，从而使多个SSAP与dCas9 gRNA形成复合物。

为了测量它们在人类细胞中的基因编辑活性，作者用编码荧光蛋白表达盒的800bp转基因提供供体，该荧光蛋白表达盒两侧有同源臂（HA），该同源臂允许荧光蛋白插入持家基因框架内，例如DYNLT1、HSP90AA1和ACTB（图3）。

图3 Design of the genomic knock-in assay to measure the level of gene-editing efficiency. FL, fluorescent; PAM, protospacer adjacent motif.  

在精确敲入后，作者测量了荧光蛋白表达细胞的百分比，以量化基因编辑效率（图4）。作者的测试表明，相对于人类细胞中的其他SSAP，RecT具有更高的编辑活性，而没有编辑仅用dCas9或非靶向对照观察到上述背景（图4）。作者使用成像、凝胶电泳和测序验证了将SSAP与dCas9偶联能够进行基因敲入编辑。

图4 Knock-in efficiency of the initial screen of three SSAPs: Bet protein from lambda phage (LBet), RecT protein from Rac prophage (RecT) and gp2.5 from T7 phage (gp2.5). NTC, non-target control. Donor templates with HA lengths of approximately 200 bp (DYNLT1) and 300 bp (HSP90AA1 and ACTB) were added in all groups, except the no-donor controls. The error bars represent the s.e.m. of n= 3 biologically independent experiments.

二、dCas9–SSAP在哺乳动物细胞中的开发

然后，作者进行了宏基因组挖掘，以确定哺乳动物基因编辑的最佳SSAP。作者专注于RecT同源物，并试图通过系统发育分析最大限度地提高进化多样性。作者在NCBI非冗余序列数据库中搜索RecT同源物，并确定了2071个初始候选。接下来，作者构建了系统发育树，对进化分支进行了子采样，并获得了16个SSAP候选者（图5）。作者通过测量三个基因组位点的编辑效率水平来评估SSAP候选者。

图5 Phylogenetic tree and amino acid alignment of representative RecT homologues along with the protein conserved domain annotated.  

作者通过测量三个基因组位点的编辑效率水平来评估SSAP候选者。在所有候选者中，EcRecT显示出dCas9编辑的最高效率，在人类细胞中的效率约为6%。这明显高于不含SSAP的dCas9对照组，后者与无供体对照组相当，表明单独的dCas9不能进行有效的敲入。作者还用不识别基因组靶标的gRNA的非靶标对照测试了SSAP，证实单独表达SSAP不足以敲入（图4）。总之，所提出的dCas9–SSAP编辑器可以在人体细胞中实现有效的敲入。

三、dCas9–SSAP编辑精确性的表征

开发dCas9–SSAP的动机是在SSAP的帮助下进行更安全、无切割的敲入编辑。因此，作者通过实验评估了dCas9–SSAP针对长度约1 kb的序列进行敲入编辑的准确性。与Cas9参考文献相比，作者测量了dCas9–SSAP的靶上误差、脱靶插入、细胞适应度效应和编辑产量。

A.靶上误差

有两种类型的目标错误：（1）仅插入indel，其中插入了不需要的indel，但没有模板；（2）不完全敲入，其中插入了完整或部分模板，但在敲入连接处发生了indel。

为了评估类型（1），作者使用深度测序来测量dCas9编辑器的靶向信息。作者使用了在供体DNA外具有初始引物结合位点的嵌套PCR设计，以避免模板污染（图6）。

深度测序显示，dCas9编辑器的靶向误差水平与阴性对照组观察到的误差水平一样低，而Cas9编辑器观察到的indel水平较高（图6）。

图6 On-target indel errors (800-kp knock-in). Deep sequencing was used to measure the levels of indel formation when using dCas9–SSAP and Cas9 references at the endogenous targets DYNLT1 (left) and HSP90AA1 (right). HDR templates with a 200-bp HA were used as the donor template. Details of the assay are provided in Methods; n= 3 biologically independent experiments. 

为了评估类型（2），作者以dCas9–SSAP的引入误差为基准，并测量了敲入连接处indels。作者克隆分离编辑的细胞，使用类似的两步嵌套PCR设计扩增敲入基因组基因座以避免污染（图7），并通过Sanger测序评估编辑的基因组等位基因。长读Sanger测序使作者能够检查全部的敲入连接处情况。

图7 On-target knock-in errors (800 kp knock-in). Clonal Sanger sequencing analysis of the accuracy of knock-in editing using dCas9–SSAP and Cas9 references with different MMEJ and HDR templates. The MMEJ and HDR donor templates had HAs of 25 bp and approximately 200 bp, respectively (Methods). c–e, Genome-wide detection of insertion sites of the knock-in cassette using unbiased sequencing.

尽管MMEJ供体在使用Cas9时比HDR供体更有效，但它们也导致了更高百分比的编辑错误（图2b）。更重要的是，就没有敲入错误的克隆百分比而言，dCas9–SSAP优于Cas9 HDR和Cas9 MMEJ（图7）。

B. 脱靶插入

作者还通过全基因组转基因插入分析评估了dCas9–SSAP编辑的脱靶敲入错误率（图8-10）。简言之，作者分离了高分子量基因组DNA，然后进行片段化和唯一分子识别器（UMI）-衔接子连接，并使用转基因特异性引物对基因组插入位点进行无偏鉴定（图8）。通过由Cas9全基因组脱靶分析（方法）修改的先前验证的分析方法，鉴定了代表高丰度转基因插入位点的富集读数峰（图9）。

图8  representative reads aligned at the knock-in genomic site  

图9 summary of the detected on-target and off-target insertion sites  

图10 summary of the detected on-target and off-target insertion sites are presented  

考虑到插入位点占总比对读数的>1%，作者的结果证实，dCas9–SSAP没有显示出可检测的脱靶插入，而Cas9参考文献导致了大量的脱靶嵌入事件（图10）。值得注意的是，与Cas9编辑器相比，当作者考虑dCas9–SSAP样本中至少有一个UMI对齐的所有位点时，脱靶位点更少。这一结果表明，dCas9–SSAP可以帮助解决在长序列敲入中脱靶这一突出问题。

C. 细胞适应度效应与编辑产量分析

作者还比较了基于Cas9/dCas9的编辑的细胞的适应度。作者试验了两个目标位点；作者的数据表明，dCas9编辑导致比Cas9更高的细胞适应度（图11，12）

为了全面了解情况，作者与Cas9参考文献相比，dCas9–SSAP的编辑产量。作者列出了准确的插入、有误差的引入和没有引入的目标误差的百分比，其中后两者的总和是目标误差总和（图13）。作者还测量了编辑的总体准确性，定义为成功敲入细胞与总编辑细胞的比率（图13）。作者观察到，Cas9编辑器在长序列编辑中经常出现错误，错误编辑的百分比明显高于产量，准确率在10%至38%之间。尽管dCas9–SSAP的敲入产量与最佳Cas9参考文献相似，但dCas9-SSAP产生的误差最小，并且在整个基因组基因座中实现了90-99%的准确率。

图10 Workflow (11) and results (12) of the measurement of the cell-fitness effect, defined by the percentage of live cells after editing (normalized to the mock controls). Statistical analyses and comparisons were performed using a Student’s t-test; *P< 0.05; ***P< 0.001; n= 5 biologically independent experiments. MESL, maximum edit site likelihood. Asterisks next to gene names indicate that the insertion site is within the transcription unit of the gene.

图(11) and results (12) of the measurement of the cell-fitness effect, defined by the percentage of live cells after editing (normalized to the mock controls). Statistical analyses and comparisons were performed using a Student’s t-test; *P< 0.05; ***P< 0.001; n= 5 biologically independent experiments. MESL, maximum edit site likelihood. Asterisks next to gene names indicate that the insertion site is within the transcription unit of the gene.

图13 Summary of the knock-in accuracy of the dCas9–SSAP editor in comparison with the Cas9 HDR and Cas9 MMEJ methods. Accuracy is defined as the overall yield (%) of correct knock-in in all edited outcomes (correct knock-in, knock-in with indels and NHEJ indels). NGS, next-generation sequencing.

四、通过供体设计和细胞类型对dCas9–SSAP的评估。

作为评估基准，作者使用了野生型和基于缺口的Cas9（nCas9）编辑器，包括三个HDR增强工具。作者检测了它们在三个基因组靶标上的1kb敲入活性。比较证明dCas9–SSAP实现了比Cas9、nCas9 和nCas9-hRAD51缺口酶编辑器更高的效率，其效率水平与两种已发表的HDR增强编辑器Cas9-HE51和Cas9-GEM52相似（图14）。作者还将dCas9–SSAP与作者以前的SSAP增强的野生型Cas9工具进行了比较，发现与引入DNA切割时相比，基于dCas9的编辑器具有强大但降低的活性，此外，作者的数据显示，单sgRNA dCas9-SSAP编辑器足以进行有效的敲入，当使用两个gRNA时有微小的提高。

图14  Comparison of the knock-in efficiencies of dCas9–SSAP and other alternative Cas9, nCas9 and HDR-enhancing tools. Cas9-HE, CtIP-fusion Cas9; Cas9-Gem, Geminin-fusion Cas9; nCas9, Cas9-D10A nickase reference; and nCas9-hRAD51, an improved Cas9 nickase editor. The same donor templates as those used in Fig. 1 were used. Statistical analyses and comparisons were performed using a Student’s t-test; *P< 0.05 and **P< 0.01.

接下来，作者用不同的供体DNA设计测试了dCas9–SSAP编辑器（图15）。作者首先测试了HA长度对dCas9–SSAP效率的影响（图16）。作者的结果表明，当使用HDR时，SSAP介导的编辑比MMEJ供体更有效，并且较长的HA通常导致更高的编辑效率（图1f和补充注释）。这与之前的报道一致，即MMEJ依赖于DNA断裂，而DNA断裂在dCas9编辑中缺失。然后，当敲入序列长度变化时，作者评估了dCas9–SSAP的编辑效率，双荧光蛋白敲入的长度高达2kb（图17）。作者的数据显示，无论转基因长度如何，dCas9–SSAP的表现始终如一，其效率与文献报道的Cas9相当，而且往往更高（图17）。

此外，作者检查了dCas9–SSAP编辑器是否可以应用于模型人胚胎肾293T（HEK293T）细胞系以外的其他细胞类型。作者将dCas9–SSAP应用于三种具有不同组织来源的细胞系（宫颈来源的HeLa细胞、肝来源的HepG2细胞和骨来源的U2OS细胞）。作者在所有三种细胞上观察到与Cas9参考相当的敲入效率。接下来，作者使用dCas9–人类胚胎干细胞（hESCs）中的SSAP编辑器，以在更具治疗相关性的环境中设计序列。

图15  Design of knock-in donors with different transgene lengths.   

图16  Gene-editing efficiencies at the DYNLT1 (left) and HSP90AA1 (right) loci in HEK293T cells for three types of donor designs with different HA lengths.

图17 Gene-editing efficiencies at the DYNLT1 (left) and HSP90AA1 (right) loci in HEK293T cells for three types of donor designs with different HA lengths. Knock-in efficiencies for different transgene lengths using the dCas9–SSAP editors. Donor-HA lengths of approximately 200 bp (DYNLT1) and 300 bp (HSP90AA1) were used; n= 2 biologically independent experiments.

作者在所有三个目标上都观察到了稳定的敲入编辑（图18）。为了避免来自供体DNA的背景，用短HA（约200bp）进行干细胞编辑，并且在没有选择的情况下实现了约3%的千个碱基量级的编辑效率。dCas9–SSAP的效率通常与Cas9相当或高于Cas9。因此，作者得出结论，dCas9–SSAP与基于Cas9的编辑器具有相似的效率水平。

图18 Knock-in gene editing in hESC (H9) cells using the dCas9–SSAP editor. The knock-in efficiencies of the Cas9, Cas9 HDR and dCas9–SSAP editors (e; n= 2 biologically independent experiments).

五、dCas9–SSAP效率优化旨在稳定的敲入编辑。

作者进一步优化了dCas9–SSAP编辑器，并在更大的基因组靶点中测试了其活性。作者首先检查了剂量的调整是否可以提高编辑效率（图19）。当作者增加SSAP编码质粒的量时，作者观察到所有靶标的编辑效率都更高（图19）。这种相关性进一步支持了插入编辑是由SSAP驱动的。相反，供体数量的增加对引入效率的影响可以忽略不计，这表明供体剂量在这种情况下不是瓶颈。除了剂量优化外，作者还延长了供体HA的长度，并观察到HA的进一步延长有助于提高引入效率，这与早期的结果一致。

使用这些优化的参数，作者测量了dCas9–SSAP在七个内源性基因座（DYNLT1、HSP90AA1、ACTB、BCAP31、HIST1H2BK、CLTA和RAB11A；图20）。囊括两个基因座（CLTA和RAB11A），其中敲入标签直接融合在内源性蛋白质的N末端，补充2A肽设计。在所有靶点中，dCas9–SSAP在没有选择的情况下表现出高达约20%的效率，这与参考文献中Cas9相当，有时也略高（图20）。

图19 Knock-in efficiencies for SSAP-dosage optimization. Donor-HA lengths of approximately 200 bp (DYNLT1), 300 bp (HSP90AA1) and 200 bp (ACTB) were used; n= 3 biologicallyindependent experiments.

图20 Performance (knock-in efficiency) of the dCas9–SSAP editor compared with Cas9 references across seven endogenous loci in HEK293T cells after SSAP-dosage optimization and donor-HA extension. Donor-HA lengths of 673 bp + 750 bp for HSP90AA1, 500 bp + 800 bp for ACTB, 608 bp + 740 bp for BCAP31, 212 bp + 413 bp for HIST1H2BK, 705 bp + 602 bp for CLTA, 464 bp + 440 bp for RAB11A and approximately 200 bp for DYNLT1 were used. All knock-in donors targeted the carboxy termini of the endogenous proteins, except for the CLTA and RAB11A donor which targeted the N termini. The error bars represent the s.e.m. of n= 3 biologically independent experiments.

为了确保dCas9–SSAP介导的编辑在较长时间内的稳定性，作者接下来检查了敲入转基因表达的持久性。作者在转染dCas9–SSAP和供体DNA后的第3天对mKate+细胞进行了分类，然后检查转基因是否在不同基因组基因座的三天窗口期后保持表达（图21）。与作者显示准确靶点编辑的测序结果一致，作者观察到敲入盒的表达在dCas9–SSAP递送后的第5、7和10天是稳定的（图21）。与对照组相比，敲入细胞群体具有明显、稳定的转基因表达。因此，这些数据为dCas9–SSAP在哺乳动物细胞中稳定敲入编辑的实用性提供了支持。

图21  Long-term stability of transgene expression at HSP90AA1 (left) and ACTB (right) post sorting on Day 3 after dCas9–SSAP knock-in. Variable sorting efficiencies led to different starting mKate+ rates .

最后，作者试图从功能上验证dCas9–SSAP编辑器在内源性基因座插入不同有效载荷的能力（图22）。简言之，作者构建了具有选择性有效载荷的敲入供体（嘌呤霉素抗性盒和blasticidin抗性盒）作为与内源性基因的融合蛋白（图23）。作者使用蛋白质印迹检查了dCas9–SSAP和Cas9参考编辑器的敲入结果。免疫印迹证实了在靶点（HSP90AA1和ACTB）和有效载荷上使用dCas9–SSAP的预期敲入融合蛋白的存在和正确大小（图23）。此外，作者使用功能分析量化了dCas9–SSAP和Cas9的相对敲入效率（图24）。

图22  Design of the genomic puromycin- and blasticidin-resistance-cassette knock-in assay to validate functional on-target editing by dCas9-SSAP.  

图23 Immunoblotting confirmation of the presence and sizes of on-target dCas9–SSAP knock-in products at the HSP90AA1 and ACTB loci, performed with antibody to V5, which recognizes in-frame fusion with endogenous protein. Data are representative of n= 3 biologically independent experiments. Schematics (not to scale) of the knock-in proteins are shown (left).

图24 Validation and quantification of on-target knock-in using dCas9–SSAP via colony formation assays. Cells were selected by the knock-in resistance cassettes, stained with crystal violet and quantified.

作者采用短HA供体将抗性盒插入内源性基因座，并应用嘌呤霉素选择敲入细胞。使用这种蛋白质测定方法，克隆形成成功地验证了dCas9–SSAP编辑器的稳定性（图24）。

六、dCas9–SSAP对内源性途径的依赖性（不做重点展示）。

回顾一下作者的模型，dCas9–SSAP在没有DNA切割的情况下进行基因编辑。为了更好地理解dCas9–SSAP编辑的性质，作者使用了三种正交化学扰动来检查其对内源性途径的依赖性。

作者使用化学微干扰的技术手段，证明了dCas9–SSAP编辑的假设机制：RNA引导的dCas9与基因组靶标结合，并使其可被SSAP访问，SSAP在不需要DNA断裂的情况下促进同源定向插入（图1）。对这一过程的更深入理解将需要进一步的研究，例如，dCas9–SSAP编辑器的生物物理分析、调节基因组可及性和修复途径的进一步分析。

七、最大限度地减少dCas9–SSAP大小,便于递送。

最后，为了优化dCas9–SSAP编辑器便于以后的应用，作者试图开发一个与病毒载体（如AAV20,21）的大小限制兼容的最小版本。基于二级结构预测，作者设计了14种不同的截断RecT SSAP（图25），并与全长对照一起测试了它们的基因编辑活性。作者鉴定了一种短RecT变体（长度约200个氨基酸），其效率与最初的基于全长RecT的设计相当（图26）。

图25 Predicted secondary structure and priming sites for constructing truncated EcRecT protein.  

图26 Relative knock-in efficiencies of the truncation designs. All groups were normalized to the Cas9 references (individually for each target). aa, amino-acid residue.

然后，作者将这个短SSAP与更紧凑的SaCas9系统和更小的N22 BoxB适体集成，以构建最小的dSaCas9–mSSAP编辑器（图26）。这使作者能够将dSaCas9–mSSAP装配到单个AAV中，并使用≤4kb的供体AAV进行长序列编辑（图26）。作者通过AAV2颗粒的递送测试了dSaCas9–mSSAP编辑器，并证实其在HEK293T细胞中具有与全长版本相当的效率（图28）。这种设计虽然需要进一步的体内验证，但可以为提供dCas9–SSAP编辑器提供一个方便的选择。

图27   Schematic of the dSaCas9–mSSAP system in AAV construct  

图28  Schematic of the dSaCas9–mSSAP system in AAV construct using the compact SaCas9 and its knock-in (800 bp) efficiencies at AAVS1 and HSP90AA1 using in vitro delivery of AAV2 vectors carrying the original and minimized dSaCas9–SSAP editors in HEK293T cells.

篇尾语

与经典的Cas9技术相比较，dCas9–SSAP基因编辑效率相当，但具有优良准确度。更重要的是，其dCas9为D10A和H840A突变体，主打一个cleavage-free，对基因的损伤更低，一定程度上提升了基因治疗在基础科研和临床应用上最重要的安全性，弥补了现有基因编辑技术的不足。dSaCas9–mSSAP可以搭载在AAV载体载体上，具有较大的临床潜力。它是一种有价值的哺乳动物细胞无切割基因编辑工具，还有进一步改进的空间。