- 我们用两篇文章的篇幅大概讲了一遍质粒骨架及其各个要素的介绍：
解剖式学习一个质粒结构--update
质粒系列之什么是质粒 - 再谈了最传统的限制性克隆：
质粒系列之限制性克隆--restriction cloning - 前面还夹杂的讲过一些piggybac、gateway、RMCE的一些内容：
基因编辑如何换药不换汤 -
慢病毒系列也有讲过两篇：
团队作案HEK293，史上最强搬砖细胞
不想再用慢病毒了，我还有什么别的选择吗？piggyBac transposon - 此外我们本还有一个CRISPR screening的专题，只有开头，未得完善：精准大海捞针--5. CRISPR screening专题
每次都想要一篇文章的篇幅讲完，但知识总是越学越知道自己的无知，于是每次就像打补丁一样这里打一下那里打一下，导致文章都不成系列，十分松散。关于Gibson assembly其实我之前也讲过，只是都不记得放在哪一篇里了。这是最近学习的笔记。
限制性克隆所谓成也限制性，败也限制性，限制性克隆的最大的限制来源于其“限制性。Gibson assembly不依赖限制性内切酶，可一步完成多个DNA序列的组装，大大提升DNA组装速率，同时还可降低载体自连的概率，是多片段DNA序列连接的首选方式。下表简单比较两种方法的特点。
| 限制性克隆 | Gibson assembly | |
|---|---|---|
| 实验原理 | 酶切连接 | 同源重组 |
| 工具酶 | 限制性内切酶、DNA连接酶；必要时需去磷酸化及磷酸化 | 核酸外切酶（5‘ or 3'）、DNA聚合酶、DNA连接酶 |
| 酶切位点 | 需特异性酶切位点 | 不依赖特异性酶切位点 |
| 末端 | 插入片段与载体粘性末端需互补，平端可直连，但平端更易自连。 | 任意末端都可经由PCR加入overlap序列，达到有“同源”可重组的效果。 |
| 优点 | 1. 单次实验花费较低，设计简单；2. 分步进行，易于查错；3. 适用于简单的片段插入，以及中等大小片段扩增无法达成或易出错时。 | 1. 效率高，操作简单，一步到位；2. 不依赖酶切位点，适用于任意片段。 |
| 缺点和隐患 | 1. 依赖特异性酶切位点，需多步进行，操作复杂，耗时较长；2. 需备多种限制性内切酶，酶存放时间过久易失活；3. 大片段（> 6 kb）连接效率不高。 | 1. 需要设计引物并通过高保真PCR扩增片段，片段过长不易扩增且易出错；2. 同源重组效率依赖于同源臂的选择，载体内有相似序列会影响同源重组效率，也有错配可能。 |
1. 一览众山小
这查资料的时候发现特别有趣，原来无论是限制性克隆还是Gibson assembly，都是出自同一个实验室/机构。
左边这位Hamilton Smith教授是II类限制性内切酶的发现者之一，并因这一发现与Daniel Nathans和Werner Arber共同获得了1978年的诺贝尔生理学和医学奖。而右边的Daniel Gibson 于2004年到 J. Craig Venter Institute(克雷格·文特尔研究所 )的 Hamilton Smith组做博后，负责细菌基因组合成的相关课题。而 J. Craig Venter则因其牵头人类基因组计划而闻名，创立了 J. Craig Venter Institute及Synthetic Genomics Inc. (SGI) 公司
2. 发现之初
从2004年Gibson入职到2008年，不到4年时间，Gibson和Smith在Science上共同发表了酵母细胞完成支原体基因组组装的文章，而这篇文章用到的DNA片段组装方法则在2009年发表于Nature Methods
从上图Nature Methods文章的摘要可看到，Gibson使用5‘核酸外切酶，DNA聚合酶和DNA连接酶完成了多DNA片段的一步连接，而这就是我们现在常用的Gibson assembly。
3. 实验过程示意
一般实验室都直接购买配好的Gibson assembly mixture，但也可自行购买T5 核酸外切酶、DNA聚合酶以及DNA连接酶配置。Gibson操作简单，具体过程和步骤都写在下图中：
需要注意的事项有：
(1) 一般说明书推荐所有片段都用PCR手段获得，但长片段会有因PCR而引入突变，因此，骨架大片段可采用限制性内切酶处理后获取。
(2) 如果两端序列中有多个同源序列，则会有错误同源重组的可能，例如Loxp序列等等。
4. 核酸内切酶 vs 核酸外切酶
对比限制性克隆和Gibson assembly，最大的区别是无需特定的酶切位点，然而实际上还是需要overlap的悬端，只是这个悬端可以由PCR带来，同时核酸外切酶的末端修整，使得overlap序列暴露，从而完成同源重组。那么核酸内切酶和核酸外切酶的差别和分类我们可以简单来学习一下：
从名字来看，内切酶切的是序列内部，外切酶切的则为外部（5’或3‘末端），具体的比较可如下表：
| Basis for Comparison | Endonuclease | Exonuclease |
|---|---|---|
| 定义 | 切割多核苷酸内部磷酸二酯键的酶类 | 可以一次从5 '或3 '端切割多核苷酸链中的DNA序列的酶类 |
| 分类 | 3类：I型和III型是大型多亚基复合物，包括内切酶和甲基化酶活性； I型可以切割距离识别序列大约1000个碱基对或更远的位点，它需要ATP作为能量来源 ；III型则可 可识别短的不对称序列，切割距离识别序列外约25个碱基对的位点，在这个过程中也需要ATP ；而II型则由Hamilton发现， 它们是内切酶的简单版本，通常识别短回文序列并直接切割该序列，在降解过程中不需要ATP | 真核生物和原核生物有三种类型的外切酶参与mRNA的正常转换: （I型）5’ - 3‘外切酶 (Xrn1)，这是一个依赖的脱壳蛋白; （II型 ）非依赖性 3′ - 5′ 核酸外切酶；（III型）poly(A)特异性3’ - 5‘外切酶。 |
| 活性迟滞期 | 由于某些核酸内切酶是限制性内切酶，因此在该酶类识别到特定位点之前，该酶不具活性，此为活性迟滞期。 | 无 |
| 切割结果 | 由于切割的是序列内部，因此产物也是多核苷酸 | 裂解DNA序列，产生单个核苷酸或核苷 |
| 末端 | 可以是平端或粘性末端 | 粘性末端 |
| 特异性 | 限制性内切酶可用于切割DNA序列中的特定位点。 | 一般无特异性 |
| 防御属性 | 部分可防御外来病原体 | 并无防御外来病原体的属性 |
| 对环状DNA的效果 | 可切割 | 对环状DNA的活性低于现状DNA |
| 可抑制性 | 内切酶硫代磷酸酯键连接的核苷酸仍具有活性，除非整个序列都是这个键。 | 对硫代磷酸酯连接的核苷酸不具活性 |
结语
两种方法自是各有优缺，虽目前多用Gibson assembly，但限制性克隆仍然常用。限制性内切酶种类繁多，其中Type IIS克隆更是被称为Golden Gate cloning。从操作时间来看，Golden Gate是最简单的方法之一，单管内酶切和连接可在30分钟内完成。由于Type IIS酶切不保留酶的识别位点，因此连接产物的形成是不可逆的，连接效率几近100%。且Golden Gate 克隆限制性克隆需分步完成的缺点，在同一管内可完成多达10个片段的连接，果子老师称之为--质粒改造的王者。下周，我们将会聊聊这Golden Gate cloning，敬请期待。
