原文链接：
Khanna N, Zhang Y, Lucas JS, Dudko OK, Murre C. Chromosome dynamics near the sol-gel phase transition dictate the timing of remote genomic interactions. Nat Commun. 2019;10(1):2771. Published 2019 Jun 24. doi:10.1038/s41467-019-10628-9
https://www.nature.com/articles/s41467-019-10628-9

摘要

抗体表达基因通过V_H - D_H J_H重排产生多样的抗体库，而该过程涉及到基因组内的远程相互作用。

本文的作者开发了一种双荧光活细胞成像手段，可以同时跟踪B淋巴细胞中V_H 与 D_H J_H片段的运动，并由此观察到：V_H 与 D_H J_H片段的在细胞核内的运动受限，只能在局部发生移动。起始距离较近的V_H 与 D_HJ_H片段在细胞核内始终靠近，而初始距离较远的V_H与D_HJ_H在观察中也一直保持较远的距离。但同时作者也观察到在少部分细胞中这种限制被打破，V_H与D_HJ_H的距离发生巨大的改变，作者认为在这些细胞中可能发生了染色质构象的改变。

通过对实验数据进行模拟建模，作者提出：正常细胞核内的染色质处于溶胶环境中，而在Igh基因座附近染色质相互交联，导致环境发生从溶胶向凝胶的相变，凝胶环境限制了V_H 与 D_H J_H片段运动。

背景

B细胞分化与VDJ重排

B细胞来源于骨髓中的共同淋巴祖细胞（common lymphoid progenitor cell, CLP，CLP分化产生pro-B细胞。
在pro-B细胞中，抗体重链基因座（Igh）发生V_H - D_H - J_H重排。这一过程中，首先发生的是D_H 与J_H连接形成D_HJ_H重组，然后V_H片段再与D_HJ_H重组。V_H - D_HJ_H重组后，pro-B细胞分化为pre-B细胞。在pre-B细胞中，抗体的轻链基因发生重组。之后，pre-B细胞分化成具有抗体表达能力的immature-B细胞，离开骨髓，迁移前往外周淋巴细胞。

在V、D、J片段侧翼分布有重组信号序列，RAG1和RAG2两种核酸内切酶可以识别并结合到该位点，引发DNA双链断裂，为基因组重排提供结构基础。V_H区分为远端和近端两个簇，在基因组约占2.7 Mb。C_H区下游有成簇的CTCF结合位点，V_H区的两侧也有CTCF结合位点，并且与C_H区下游的CTCF结合位点方向相对。结合在V_H区两侧的CTCF将V_H区与D_HJ_H区隔离，抑制过早发生V_H片段与D_HJ_H片段重排

Figure 1a

V_H - D_HJ_H区域的表观遗传修饰

在Igh 的基因座，V_H - D_HJ_H区域的DNA上有大量的表观遗传修饰。这些修饰是发育阶段特异性的，参与V_H - D_HJ_H重排。

E2A和HEB蛋白参与此过程。具体而言，Igh基因座内有E2A结合位点，E2A结合到Igh基因座后募集乙酰转移酶 P300，使结合位点所在区域内的染色质的组蛋白的H3 和H4尾部的赖氨酸残基发生乙酰化修饰，并进一步招募染色质重塑因子BRD4，促进染色质内部交联并发生相分离。在活化的成熟B细胞中，研究者和观察到E2A蛋白聚集成液滴形状。

方法建立

之前的研究可以使用单荧光标记V_H片段或D_HJ_H片段，观察它们在基因组中的运动。而本文开发了一种双色荧光标记手段（Figure 1），可以同时对活细胞内的V_H片段和D_HJ_H片段的运动轨迹进行追踪，并测量两片段之间的距离。

通过与3D-FISH的结果进行比较，作者证明了新开发方法的有效性（Figure 2）。

主要发现

细胞核内V_H与D_HJ_H片段运动轨迹受限

根据双荧光成像结果，作者计算了不同细胞内的V_H片段与D_HJ_H片段间的距离随时间变化的曲线，得到Figure 3a，图中每条曲线代表一个细胞。

首先，由于图中检测到的V_H片段与D_HJ_H片段间的距离变异幅度较大（距离从0.2-1.2 μm不等），作者认为这表明在群体细胞中Igh基因座的染色质构型具有多样性。并且因为二者间的距离分布呈双峰状，所以作者提出Igh基因座应当至少存在2种优势染色质构型。按照每个细胞内的V_H与D_HJ_H片段在400s内的平均距离对曲线进行染色后可以看出，不同颜色的曲线明显分层。即V_H与D_HJ_H间的距离相对恒定，仅围绕某一平均值上下浮动。

总之，以上的结果表明，V_H与D_HJ_H片段的运动高度受限，可以在局部空间内移动，但是整体距离保持稳定。

Figure 3a

接下来，作者使用均方位移（mean-squared displacements，MSD）和速度自相关函数（velocity autocorrelation functions）两个指标进一步说明此问题。均方位移计算了不同位点在长度为τ移的一段时间内的位移的平方的平均值。而速度自相关函数则计算了位点对在相隔为τ的一段时间前后的速度平均值的相关程度（平均速度计算自位点在长度为δ的时间内的位移）。

Figure 3b显示了每个细胞内MSD随τ的变化曲线，对所有细胞进行平均得到Figure 3C。根据MSD ~ τ 曲线计算出scaling exponent α (MSD与时间τ的α次方程正比），无论是D_HJ_H-D_HJ_H （染色体间，绿色）还是V_H-D_HJ_H（染色体内，红色）的 α 都小于1，这表明二者的扩散受到限制（subdiffusive），且V_H-D_HJ_H受到的限制更强（α更小）。速度自相关函数随τ的变化曲线显示，V_H与D_HJ_H两个片段间的运动呈现负相关关系（Fig 3d），作者认为这可能是因为环境对其起到了push-back作用。

Figure 3b-d

尽管在大多数细胞中，V_H与D_HJ_H的距离相对恒定，但是作者也指出在大约10%的细胞中，V_H-D_HJ_H距离变异较大，MSD ~ τ 曲线的α系数急剧上升，即在这些细胞中，V_H与D_HJ_H片段运动受到的环境约束较小。作者认为在这些细胞中可能发生了染色质构象变化。

染色质环限制V_H-D_HJ_H的全局运动

为了探究环境限制V_H-D_HJ_H运动的机制，使用分子动力学模拟手段对染色质构象进行建模，来模拟使用3D-FISH实验手段绘制得到的V_H-D_HJ_H的空间距离随二者在基因组上的线性距离变化的函数曲线。

首先，作者指出3D-FISH距离曲线中一个重要特点是有一个平台期。作者作者将染色质视为弹簧串珠结构，构建了4种不同的模型：
（1）无结构限制模型
（2）单环构象
（3）双环构象
（4）多环或环境限制构象

模拟结果显示，只有多环构象可以再现出平台期这一特点（Figure 4a）。因此，作者提出，染色质环可能是V_H-D_HJ_H运动的主要限制来源。

Figure 4a

染色质Igh位点处于弱凝胶状态

然而，尽管多环染色质构象可以模拟出3D-FISH距离曲线中的平台期，但是基于该模型模拟产生的V_H-D_HJ_H距离随时间变化曲线的变异幅度过大，导致不同细胞的距离-时间曲线交织在一起（Figure 4c），与Figure 3a中观察到的曲线分层特征明显不符。因此，作者认为除染色质环以外应当还存在另外一种限制，对V_H和D_HJ_H片段的局部运动进行约束。

Figure 4b-c

作者假设第二层约束来源于染色质交联作用。

之前有研究提出了超级增强子介导染色质交联引起相分离的模型[1]。作者认为在V_H-D_HJ_H重排过程中可能也存在类似的机制。作者假设在染色质中存在5%的可供交联的位点，这些位点间按照设定的反应动力学特征动态地发生可逆的交联与解交联（Figure 4b, Supplementary Methods）。随着处于交联态时间的增长，距离~时间函数的波动范围逐渐减小。当交联完全不可逆时（τ = + ），距离~时间轨迹完全分层。

之后，作者进一步提出交联的染色质与未交联的染色质之间形成两相，前者形成凝胶相（固相），而后者处于溶胶相（液相）。作者想探究Igh基因座在相图中具体处于什么位置。为此，作者在模型中尝试不同的交联强度，从不可逆（强凝胶）到可逆（弱凝胶），到交联完全不能发生（溶胶）。基于不同的交联强度计算模拟产生的MSD ~ τ 曲线也不同，当τ=10s（红色曲线）时，模拟值与实验值最为接近（Fig. 5a）。因此，作者认为Igh基因座所处环境应当属于一种弱凝胶状态，在相图中临近凝胶和溶胶的两相交界处。

Figure 5a

总之，以上结果共同表明，染色质环限制了Igh位点的全局构象，而交联作用则对位点的局部构象变化进行限制，二者共同导致了V_H-D_HJ_H的运动表现为subdiffusive。

弱凝胶状态下 V_H-D_HJ_H相遇的时-空关系

双色荧光捕捉系统使得作者可以观测到V_H与D_HJ_H片段首次发生相遇的时间（first-passage times, FPT）（考虑到检测误差，当V_H与D_HJ_H的距离小于某一阈值后，即被认定为相遇）。
对于V_H-D_HJ_H初始距离较远（＞0.55 μm）的细胞亚群，在整个成像时间范围内几乎检测不到V_H与D_HJ_H相遇。而在V_H-D_HJ_H初始距离较近（<0.55 μm）的细胞亚群中，超过40%的细胞中的V_H与D_HJ_H片段在几分钟内相遇（Fig. 5b）。基于模型的模拟预测结果与实验结果相一致（Fig 5c）。

Figure 5b-c

接下来，作者还探究了FPT与V_H-D_HJ_H空间位置的关系,模拟结果与实验数据也显示出了良好的一致性，二者共同显示，FTP与V_H-D_HJ_H的平均距离呈正相关关系，斜率大约为2/α，这与之前报道的研究结果也具有良好的一致性（Fig. 5d）。

这些结果再次支持了Igh基因座所在的染色质环境可能属于弱凝胶。

Figure 5d

讨论

本文开发了一种可以同时追踪V_H和D_HJ_H片段的运动轨迹的实验方法，并由此观察到了V_H和D_HJ_H片段的运动具有subdiffusive的特点。这种限制使得当V_H与D_HJ_H在空间中的起始距离较近时，可以更有效地搜寻到对方。同时与之相对的，当二者在空间中的起始距离较远时，环境限制可以进一步降低他们相遇的可能性。染色质环参与这样一过程。通过将D_H与J_H在空间中拉近，并将V_H与二者分隔，从而对D_H与J_H的重连其促进作用，同时阻止V_H与D_HJ_H过早地重排。

此外，本文提出，Igh基因所在的染色质位点处于弱交联状态，在相图中位于凝胶相内，但靠近凝胶与溶胶相的边界。因此，细胞可能可以通过对交联的强度进行调控，细微的变化就可以使局部染色质从溶胶相切换至凝胶相，形成相分离液滴，促进相同液滴内的染色质片段的相遇，并对对位于液滴内外或不同液滴的染色质片段的相遇起阻碍作用。而当交联减弱染色质状态从凝胶相向溶胶相变化时，液滴溶解，可以为下一次重新形成液滴做准备，从而实现Igh位点快速有序的组装（Fig. 6）。

Figure 6

尽管本文提出的模型可以很好的解释实验数据，但是不能排除其他机制参与的可能性。因此，想确切地证明交联对V_H-D_HJ_H的运动的影响，还需要对参与交联的分子进行进一步探究。比如，参与交联的分子有怎样的性质？这些分子是如何聚集并被调控的？

已有的研究表明，pro-B细胞中存在复杂的染色质互作网络，并且该互作网络不依赖于CTCF，而是与E2A，PU.1，FOXO1以及PAX5有相关。这其中， E2A蛋白引起了作者的特别兴趣。该蛋白已被观察到在发育过程中可以聚集形成液滴，并且参与抗原受体基因座的组装调控。已有的遗传和生化证据显示，E2A将 P300 和 BRG1 募集到 E2A 结合位点。BRG1的功能尚不清楚，但是已知P300的可以乙酰化组蛋白 H3 和 H4 尾部的赖氨酸残基，并进而招募BRD4。此外，E2A自身包含有转录激活结构域，且这些结构域大多是无序的，可以像其他转录调节因子一样聚集形成液滴。

尽管在大多数细胞中，V_H和D_HJ_H的运动表现为强烈地subdiffusive，但也存在一小部分细胞，他们的α指数突然升高。作者认为这种升高是由染色质构象的瞬时变化引起的，这些变化包括形成染色质环、DNA复制结构域或者核变形。其中最有可能的是形成染色质环，染色质环的形成可以重排Igh基因座内的V_H区域，将不同的V_H片段递送至重组中心。

本文的研究证明了基因组结构如何影响抗原受体编码基因中V_H-D_HJ_H的运动。具体而言，受限于染色质结构，只有在空间中相对临近的V_H-D_HJ_H才有机会组装在一起。那么接下来还有一个问题：这种机制如何建立多样化的受体库。对此，作者提出了以下机制：首先，染色质环将 D_H与J_H围在一个互作域（loop domain）中，在这个结构域中，转录因子诱导交联，促进凝胶液滴形成。液滴内， D_H与J_H有更高的概率相遇，同时液滴阻止了 D_H或J_H先与V_H发生连接。D_H-J_H重连接产物形成后，转录因子活性下降，表观遗传标记被擦除，液滴溶解。染色质形成一个新的将V_H 与D_HJ_H同时包含在内的染色质环，E2A、EBF1 和 PAX5 等转录因子将指导 P300 乙酰化动V_H内的H3 和 H4 残基，促进凝胶液滴形成，使得与D_HJ_H靠近的 V_H与D_HJ_H连接，发生V_H-D_HJ_H重排。在此模型下，不是整个的V_H区域尝试与D_HJ_H连接，而是只有位于附近的少数特定几个V_H片段有机会参与重排。

此外，作者还提出：重排过程中的等位基因排斥（allelic exclusion）现象也可以被相分离模型解释。转录调节因子可以通过建立或擦除组蛋白上的乙酰化修饰，调节液滴的快速组装与解体，从而保障重排可以快速发生，并在之后不需要的时候被抑制。

参考文献

[1] Boija, A. et al. Transcription factors activate genes through phase-separation capacity of their activation domains. Cell 175, 1842–1855 (2018).