本文选自Nature Immunology，https:/ / doi.org/10.1038/ s41590-019-0589-5，喜欢的朋友可以自行下载阅读。
summary：消耗调节性T细胞（Treg细胞）以对抗肿瘤微环境（TME）的免疫抑制特性是肿瘤治疗的一个有吸引力的策略；然而，由于其抑制功能的系统性损害而导致的自身免疫性限制了其治疗潜力。阐明特异性破坏肿瘤内Treg细胞的方法是肿瘤免疫治疗的迫切需要。作者发现CD36作为一种中枢代谢调节剂在癌内Treg细胞中选择性上调。CD36通过过氧化物酶体增殖物激活受体-β信号调节线粒体适应度，编程Treg细胞适应富含乳酸的TME。在不破坏免疫平衡的情况下，基因消融Treg细胞中Cd36可抑制肿瘤生长，并伴有肿瘤内Treg细胞减少和肿瘤浸润淋巴细胞抗肿瘤活性增强。此外，CD36靶向诱导抗程序性细胞死亡蛋白1治疗的附加抗肿瘤反应。我们的发现揭示了未经探索的代谢适应，它协调了肿瘤内Treg细胞的生存和功能，以及靶向这一途径重新编程TME的治疗潜力。
introduction：尽管消耗Treg细胞的策略增加了抗肿瘤反应，但由于Treg细胞的系统性消耗和效应T细胞的不必要消耗而导致的严重自身免疫性限制了Treg靶向方法的治疗潜力。目前针对免疫检查点如OX40、糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体相关蛋白(GITR)和细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA4)等治疗可以造成Treg细胞的系统性消耗，也阻碍了其用于Treg的靶向治疗。迄今为止，寻找有效的靶向方法选择性地摧毁肿瘤内Treg细胞仍然是癌症免疫治疗的一个挑战。新出现的证据显示，代谢机制和营养感知机制在微调Treg细胞21-27的增殖、存活、抑制功能和谱系稳定性方面起着关键作用。由于肿瘤微环境(TME)可以对浸润的免疫细胞施加各种类型的代谢压力，包括酸中毒、缺氧和营养缺乏，因此肿瘤内Treg细胞很可能必须调整它们的代谢偏好，以响应这些条件，作为适应TME的结果。因此，推测瘤内Treg细胞参与的代谢适应协调信号通路以支持生存和抑制活动。
作者在此报道，肿瘤内的Treg细胞通过过氧化物酶体增殖物激活的受体-β(PPAR-β)依赖的机制上调CD36的表达，以支持线粒体的适合性和生物发生。CD36在Treg细胞中的基因消融选择性地降低了瘤内Treg细胞的丰度和抑制活性。重要的是，基因去除Treg细胞中CD36的小鼠没有诱导自身免疫，CD36缺陷的脾脏Treg细胞在限制T细胞转移诱导的结肠炎方面仍然有效。作者的结果表明，CD36 PPAR-β信号通过调节线粒体适应性和NAD水平来维持瘤内Treg细胞的生存和功能适应，而线粒体适应性和NAD水平对TME中乳酸的代谢至关重要。进一步提供了验证证据，证明用单克隆抗体靶向CD36可以诱导良好的抗肿瘤免疫，并通过抗程序化细胞死亡蛋白1(anti-PD-1)治疗引起相加的抗肿瘤反应。
瘤内Treg细胞增加脂质代谢和CD36表达
为了阐明瘤内Treg细胞是否优先参与特定的代谢途径，在先前发表的一项研究中，作者首先分析了来自乳腺癌患者的瘤内和循环Treg细胞的RNA测序(RNA-Seq)结果。发现瘤内Treg高表达基因主要富集在脂代谢通路上。
当比较来自非小细胞肺癌(NSCLC)患者的外周血单个核细胞(PBMC)和瘤内Treg细胞时，瘤内Treg细胞内化了更多的BODIPFL C12(一种绿色荧光脂肪酸)，并且基于BODIPY染色，含有更高的中性脂质含量。
为了进一步探索这些表型，我们使用黑色素瘤细胞植入模型来评估驻留在肿瘤和其他外周组织中的Treg细胞的脂质代谢。与YUMM1.7黑色素瘤小鼠其他组织的Treg细胞相比，瘤内Treg细胞显示出吸收脂肪酸的能力提高，并且具有更高的脂质含量，B16黑色素瘤小鼠和MC38结肠癌小鼠的肿瘤内Treg细胞也表现出增强的脂肪酸摄取，说明这种脂代谢重组在多种肿瘤中存在，在人和小鼠模型中，脂质代谢的增加，特别是肿瘤内Treg细胞的脂质摄取是一个保守的表型
既往研究发现在控制脂质摄取的基因中，Cd36（编码一种负责长链脂肪酸和氧化低密度脂蛋白摄取的清道夫受体）在肿瘤内Treg细胞中的表达明显高于乳腺癌患者的循环Treg细胞，通过检测黑色素瘤患者外周血单个核细胞（PBMCs）和TILNs中的Treg细胞，作者证实大多数患者的肿瘤内Treg细胞表达更高数量的CD36。在鼠的黑色素瘤中也有同样的表现。
作者发现在从癌细胞培养物获得的条件培养基中培养可诱导的Treg细胞（iTreg细胞）显著增加CD36的表达，而缺氧和乳酸不能诱导Treg细胞中CD36的表达，脂质去除消除了癌细胞条件培养基对刺激Treg细胞CD36表达的影响。这表明是培养基中的脂质起到了作用。
作者下面看了看过表达CD36是不是改变了Treg的生物学行为。将CD36 fl/fl小鼠与Foxp3YFP-Cre小鼠杂交，制备了Treg细胞特异性CD36缺陷小鼠（即Treg-CD36-/-），因为全身性抑制Treg会导致严重的免疫失调，作者显示观察了Treg-CD36-/-免疫稳态的问题。作者对比了TregCD36–/–小鼠与Foxp3YFP Cre小鼠CD4+和CD8+T细胞室中也含有相似比例的效应器或记忆群体（CD44hiCD62Llo）,Treg Cd36–/—小鼠在不同器官中没有淋巴细胞和髓细胞的异常浸润，也没有出现严重的全身炎症性疾病。
这样作者的顾虑消除了，进一步把YUMM1.7黑色素瘤细胞移植到Treg-CD36-/-鼠中，肿瘤内Treg细胞的脂质摄取和含量降低，但不会降低脾脏Treg细胞的脂质摄取和含量（图2b，c），这表明肿瘤内Treg细胞依赖Cd36的表达来支持脂质摄取的增强，肿瘤的生长也减小。同时作者在B16黑色素瘤和MC38结肠癌观察到同样的结果。
作者发现在实验结束时肿瘤内浸润的Treg细胞明显减少，但脾脏和引流淋巴结中的Treg细胞没有减少（图2f和扩展数据图2f）。这伴随着CD8+肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）频率的显著增加，以及肿瘤内CD8+与Treg细胞的比率增加（作者说这个比例反应了强抗肿瘤反应相关的参数），作者为了说明这种CRE鼠对全身的Treg没有影响，仅仅是改变了瘤内浸润的Treg，为临床应用做铺垫。
在Treg Cd36-/-小鼠中较高频率的CD8+TIL和CD4+TIL产生抗肿瘤效应细胞因子，包括干扰素-γ（IFN-γ）和肿瘤坏死因子（TNF）,说明瘤内Treg清除增强了TME的免疫活性。
为了进一步验证CD36对于Treg聚集的依赖作用，作者构建了Foxp3YFP-Cre/+CD36 fl/fl雌性小鼠，该小鼠同时拥有野生型Treg群体和由X染色体失活介导的FoxP3表达驱动的CD36缺陷Treg群体，也就是说这是一个杂合CD36的鼠。根据黄色荧光蛋白（YFP）的表达，可以检测到野生型和CD36缺陷型Treg细胞，为了排除Cre重组酶的潜在毒性，我们还制作了杂合子Foxp3YFP-Cre/+雌性小鼠作为对照小鼠。发现Foxp3YFP-Cre/+CD36 fl/fl鼠瘤内Treg比例降低。这一结果提示CD36表达的缺失通过内在调节选择性地干扰了肿瘤内Treg细胞的积累。说明是CD36赋予了Treg在瘤内聚集的能力。
作者还发现在小鼠黑色素瘤模型中，肿瘤内效应细胞Treg细胞（CD44hiCD62Llo）的CD36表达高于肿瘤内CD44loTreg细胞（静息Treg细胞）。类似地，与黑色素瘤患者和健康供体外周血单个核细胞中的GITR+CD25+效应Treg细胞相比，黑色素瘤患者TILs中浸润GITR+CD25+效应Treg细胞（效应Treg细胞的最具抑制性亚群）的肿瘤百分比更高。
缺乏CD36的Treg细胞降低了GITR和OX40的表达，但没有降低PD-1、CD25、CTLA-4或诱导性T细胞共刺激因子（ICOS）的表达，这些结果提示CD36的表达有助于Treg细胞的抑制功能。
在体外抑制实验中，来自Treg Cd36–/-小鼠的肿瘤内Treg细胞显示出与野生型肿瘤内Treg细胞相比的抑制能力降低（图3i）。然而，野生型和CD36缺陷型脾脏Treg细胞显示出类似的抑制能力，这表明CD36仅用于支持肿瘤内Treg细胞的抑制活性。为什么呢？都是CD36缺陷，为什么在脾脏里就没有免疫抑制作用了呢？只能说明一个问题，可能Treg的激活在肿瘤内是以CD36依赖性的，而在肿瘤外是CD36非依赖性的，并且在肿瘤内可能通过GITR和OX40这个途径发挥作用。
为了进一步研究CD36对Treg细胞抑制外周炎症的作用，作者分析了CD36缺陷Treg细胞抑制T细胞转移诱导结肠炎的能力，用CD4+T细胞转移构建了结肠炎模型。发现野生型和CD36缺乏性鼠体重减轻一致的。野生型和CD36缺陷型Treg细胞的共移植阻碍了淋巴细胞和髓细胞的浸润，也阻碍了结肠和小肠的形态学改变，结肠缩短和脾脏增大
Cd36的基因消融既不影响激活标记物的表达，包括CD44、CD103和杀伤细胞凝集素样受体G1，也不影响肿瘤内Treg细胞中FoxP3的表达
然而，缺乏CD36的肿瘤内Treg细胞略微增加了促炎细胞因子IFN-γ和TNF的产生，这表明CD36抑制了肿瘤内Treg细胞产生促炎细胞因子的能力。
为了研究TME中CD36缺陷Treg细胞减少的原因，首先通过染色Ki67检查增殖能力。CD36缺乏并没有改变肿瘤内Treg细胞的增殖。然而，我们在cd36缺陷的肿瘤内Treg细胞中观察到较高数量的裂解caspase-3和annexin V染色。CD36缺乏并没有增加胸腺和其他次级淋巴器官Treg细胞中caspase-3的裂解丰度，只是引流淋巴结中caspase-3的略微增加，这表明肿瘤内Treg细胞需要CD36介导的调节来防止凋亡。
有研究表明线粒体代谢和适应度被认为可以调节Treg细胞的抑制功能和存活率，因此作者研究CD36缺陷的肿瘤内Treg细胞是否不能改变线粒体适应度。值得注意的是，与野生型Treg细胞相比，CD36缺陷的肿瘤内Treg细胞，而不是其他组织中的Treg细胞，显示出线粒体膜电位降低。电子显微镜分析进一步支持了这一观察结果，我们发现来自TregCd36-/-小鼠的肿瘤内Treg细胞的线粒体更少，每个线粒体的嵴更少。然而，野生型和CD36缺乏的脾脏Treg细胞显示出相当数量的线粒体和嵴密度。
通过对荷瘤Foxp3YFP-Cre/+CD36fl/fl和Foxp3YFP-Cre/+雌性小鼠的YFP+肿瘤内Treg细胞转录组的检测，发现肿瘤内CD36缺陷的Treg细胞（Foxp3YFP-Cre/+Cd36fl/fl小鼠的Cre+细胞群）编码线粒体转移RNA序列的线粒体基因表达较少，而线粒体转移RNA序列控制电子传递链蛋白质的翻译。
这一结果进一步支持了CD36缺陷的肿瘤内Treg细胞不能维持线粒体的适应性。为了进一步阐明CD36对Treg线粒体代谢的影响，我们用癌细胞条件培养基处理野生型或CD36缺陷型CD4+T细胞产生的iTreg细胞，诱导CD36表达，如前所示。然后，我们进行海马细胞外流量分析（做代谢的朋友们应该都懂吧，我不懂），发现缺乏CD36的Treg细胞具有降低的耗氧率，但增加了糖酵解率。也就是说 CD36增强了细胞适应能力。
这些结果表明，CD36的消融可以损害氧化磷酸化（OXPHOS），并使Treg细胞对有氧糖酵解的代谢偏好发生偏斜。根据这些观察，我们推测肿瘤内Treg细胞中CD36表达的增强可能通过调节线粒体适应度来支持Treg的代谢灵活性，以应对TME引起的代谢应激。那么，CD36缺失是否使Treg细胞减弱了代谢适应性。与正常培养条件（RPMI培养基加10%胎牛血清（FBS）；指定RPMI）相比，暴露于癌细胞条件培养基的CD36缺陷Treg细胞的存活率降低。
因为乳酸是TME常见的特征，所以，是不是乳酸导致了cd36缺失Treg的凋亡呢？作者在培养基中加入乳酸，随着乳酸浓度升高，CD36缺失Treg细胞生存明显受到抑制。
最近的一项研究表明，电子传递链活性的提高导致了Treg细胞中支持乳酸转化为丙酮酸的NAD/NADH比率的增加，这可以支持Treg细胞在富含乳酸的条件下存活。作者推测与野生型Treg细胞相比，CD36缺乏的Treg细胞可能由于线粒体适应度和OXPHOS的降低而具有较低的NAD/NADH比率。事实上，与野生型Treg细胞相比，CD36缺陷Treg细胞具有较低的NAD/NADH比率，并且补充烟酰胺核糖补充NAD部分挽救了暴露于癌细胞条件培养基的CD36缺陷Treg细胞的生存能力。
CD36缺陷的肿瘤内Treg细胞在体内的存活可能是由于线粒体适应度和OXPHOS的降低，这使得Treg细胞能够通过NAD调节的代谢过程在富含乳酸的条件下存活。为了了解CD36如何刺激肿瘤内Treg细胞的线粒体适应度，作者评估了乳腺癌患者肿瘤内和循环Treg细胞转录本的变化，肿瘤内Treg细胞上调控制线粒体功能和生物发生的基因。
作者发现肿瘤内Treg细胞显示参与PPAR信号通路的基因表达增加，基于以往的研究，报名Treg可以通过PPAR信号通路调节代谢重组，那么作者认为CD36诱导的代谢重编程可能通过提供脂质信号来调节PPAR转录调节，从而促进肿瘤内Treg细胞线粒体的适应性。
为了验证这一点，我们将PPARfl/fl和PPARβfl/fl小鼠与Foxp3YFP-Cre小鼠杂交，分别获得Treg特异性PPAR-β缺陷小鼠（指定Treg-PPARβ-/-）和PPAR-γ缺陷小鼠，Treg-Pparβ-/-小鼠再现了Treg-Cd36-/-小鼠的特征，包括肿瘤内Treg积聚减少、植入的YUMM1.7黑色素瘤生长减速和CD8+TILs增加,线粒体膜电位降低，而PPAR-γ缺陷小鼠没有观察到相似的表型变化。PPAR-β缺陷的肿瘤内Treg细胞表达的CD36更少.
作者进一步发现，与荷瘤小鼠脾脏和引流淋巴结中的Treg细胞相比，肿瘤内Treg细胞上调了PPAR-β多靶基因的表达，提示肿瘤内Treg细胞可能增加PPAR-β的活性。
为了阐明CD36与PPAR-β激活之间的关系及其在支持肿瘤内Treg细胞积聚中的作用，作者推测，PPAR-β选择性激动剂（GW501516）可以绕过CD36的要求，以维持CD36缺陷的肿瘤内Treg细胞的线粒体适应度和存活率。
然后，用GW501516或对照载体治疗YUMM1.7黑色素瘤移植物野生型小鼠和Treg-Cd36-/-小鼠2周，发现用GW501516治疗恢复了Treg-Cd36-/-小鼠的肿瘤生长和肿瘤内Treg细胞丰度。此外，与二甲基亚砜（DMSO）处理的Treg-Cd36-/-小鼠相比，经GW501516处理的Treg-Cd36-/-小鼠的肿瘤内Treg细胞的线粒体膜电位增加，cleave-caspase-3的减少。GW501516对CD36缺陷Treg细胞的治疗增加了NAD与NADH的比率
以上表明CD36控制的脂质摄取激活PPAR-β途径，以支持线粒体适应性和肿瘤内Treg细胞NAD与NADH比率的增强。此外，PPAR-β途径的激活可能通过增强CD36的表达进一步增强CD36介导的肿瘤内Treg细胞的代谢适应。CD36-PPAR-β信号调节代谢程序以支持TME中Treg的存活。
既然CD36仅仅存在于肿瘤内的Treg中，那么靶向CD36+Treg会改善肿瘤免疫治疗的效果吗？作者进一步进行了验证。发现抗CD36单克隆抗体治疗降低了肿瘤生长，并伴有肿瘤内Treg细胞的减少积聚，肿瘤浸润CD8+T细胞明显增多，但是在脾和淋巴结内的Treg并没有发生改变。
用抗CD36单克隆抗体治疗小鼠可改善CD8+和CD4+TILs中抗肿瘤效应细胞因子的产生。
并非只有Treg细胞才能表达CD36，还有其他免疫细胞也能表达，那么，是不是Treg产生的效应呢？作者使用Treg Cd36–/–小鼠作为受体进行了相同的治疗。我们的结果表明，抗CD36单克隆抗体治疗不能抑制Treg-CD36-/-小鼠的肿瘤进展，也就证明了这个抗体确实是通过Treg发挥作用的。
在ICB治疗中，如果CD8+T细胞减少，肿瘤治疗效果也会下降，但是作者发现CD36-/-鼠肿瘤内浸润的CD8+T细胞会怎多，可能有CD8+T细胞的激活作用，所以联合抗CD36和ICB治疗会不会增加治疗效果，作者进一步验证。作者发现抗PD-1单克隆抗体与野生型小鼠相比，更有效地限制了携带肿瘤的Treg Cd36–/–小鼠的肿瘤进展和延长生存期。
这些结果表明，在Treg细胞中靶向CD36可能使TME重新编程，以适应更多的免疫刺激条件，这可能在治疗上补充PD-1阻断对T细胞衰竭的作用。
文中需要进一步解决的问题：1.肿瘤内Treg细胞的抑制功能是由脂源性信号调节的还是乳酸的增强使用尚不清楚。2.最近的一项研究报告称，肿瘤内Treg细胞由于糖酵解增加而增加脂质含量，糖酵解支持脂肪酸合成和细胞扩张。与作者关于肿瘤内Treg细胞增加脂质摄取的结论相反，作者没有在荷瘤小鼠体内注射BODIPY结合脂质观察到肿瘤内Treg细胞脂质摄取的增加。3.由于暴露于癌细胞条件培养基刺激Treg细胞中CD36的表达，而PPAR-β缺陷的Treg细胞表达较低水平的CD36，肿瘤细胞产生的脂质可能作为免疫抑制调节因子，支持肿瘤内Treg细胞参与CD36依赖的代谢适应，文中并未阐明是哪些脂质起到作用，显然，如果知道这些脂质的特异性功能，那么对于肿瘤治疗会有一定益处。
好文分享结束，这篇文章虽然是免疫，但是通俗易懂，欢迎批评、指正。
最后安利一个Treg在肿瘤免疫的综述。http://www.lifescience.net.cn/html/201709/20170904.htm。好文共享。
做Treg流式的gating strategy
