使用二代数据或三代数据得到contig后，下一步就是将contig提升到染色体水平。对于二倍体物种而言，目前3D-DNA应该是组装效果最好的一个软件。
一：工作流程
使用3D-DNA做基因组组装的整体流程如下图，分别为组装，Juicer分析Hi-C数据，3D-DNA进行scaffolding，使用JBAT对组装结果进行手工纠正，最终得到准染色体水平的基因组。
二： 软件安装
在安装之前，确保服务器上有了下面这些依赖软件工具
- LastZ（仅在杂合基因组的二倍体模式下使用）
- Java >= 1.7
- GNU Awk >= 4.02
- GNU coreutils sort > 8.11
- Python >= 2.7
- scipy, numpy, matplotlib
- GNU Parallel >=20150322 (不必要，但是强力推荐)
- bwa
我们需要安装两个软件，一个是3D-DNA，另一个是juicer。
CPU版本的juicer安装
mkdir ~/soft
git clone https://github.com/theaidenlab/juicer.git
cd juicer
ln -s CPU scripts
cd scripts/common
wget https://hicfiles.tc4ga.com/public/juicer/juicer_tools.1.9.9_jcuda.0.8.jar
ln -s juicer_tools.1.9.9_jcuda.0.8.jar juicer_tools.jar
然后用~/soft/juicer/scripts/juicer.sh -h检查是否有帮助信息输出。
3D-DNA安装
cd ~/soft
git clone https://github.com/theaidenlab/3d-dna.git
用sh ~/soft/3d-dna/run-asm-pipeline.sh -h查看是否有帮助文档输出。
参数详解
以CPU版本的为例，juicer.sh的参数如下
Usage: juicer.sh [-g genomeID] [-d topDir] [-s site] [-a about] [-R end]
[-S stage] [-p chrom.sizes path] [-y restriction site file]
[-z reference genome file] [-D Juicer scripts directory]
[-b ligation] [-t threads] [-r] [-h] [-f] [-j]
参数说明：
- -g: 定义一个物种名
- -s: 酶切类型, HindIII(AAGCTAGCTT), MboI(GATCGATC) , DpnII(GATCGATC), NcoI(CCATGCATGG)
- -z : 参考基因组文件
- -y: 限制性酶切位点可能出现位置文件
- -p: 染色体大小文件
- -C: 将原来的文件进行拆分，必须是4的倍数，默认是90000000, 即22.5M reads
- -S: 和任务重运行有关，从中途的某一步开始,"merge", "dedup", "final", "postproc" 或 "early"
- -d: juicer的目录 我们安装在/soft/，所以设置为/soft/juicer
- -D: juicer scripts的目录，我们安装在/soft/，所以设置为/soft/juicer/CPU
- -a: 实验的描述说明，可以不用设置
- -t: 线程数
如果你的基因组不是复杂基因组，比如说高杂合，高重复序列，或者Hi-C数据测太少，那么3d-dna的流程更加简单, run-asm-pipeline.sh -h只有四个参数需要改:
- -i|--input: 过滤长度低于给定阈值的contig/scaffold, 默认是15000
- -r|--round: 基因组中misjoin的纠错轮数，默认是2，当基因组比较准确时，设置为0，然后在JABT中调整会更好
- -m|--mode: 是否调用merge模块，当且仅当在杂合度比较高的情况下使用，也就是组装的单倍型基因组明显偏大
- -s|--stage: 从polish, split, seal, merge 或finalize 的某一个阶段开始
但是，一旦基因组复杂起来，那么需要调整的参数就非常多了, run-asm-pipeline.sh --help会输出更多的信息，你需要根据当前结果去确定每个阶段的参数应该如何调整。
最终的输出文件最关键的是下面三类:
- .fasta: 以FINAL标记的是最终结果
- .hic: 各个阶段都会有输出结果，用于在JABT中展示
- .assembly: 各个阶段都会有输出，一共两列，存放contig的组装顺序
三：分析流程
准备两个数据:
- reference:存放一个genome.fa, 为组装的contigs。
- fastq: 存放HiC二代双端测序结果，read_R1_fastq.gz, read_R2_fastq.gz
有了这两个数据就可以开始了。
1. 准备一个新的基因组
第一步：为基因组建索引
bwa index genome.fa
第二步: 根据基因组构建创建可能的酶切位点文件
python /data1/spider/ytbiosoft/soft/juicer/misc/generate_site_positions.py DpnII genome genome.fa
第三步: 运行如下命令, 获取每条contig的长度
awk 'BEGIN{OFS="\t"}{print $1, $NF}' genome_DpnII.txt > genome.chrom.sizes
2.运行juicer
保证当前目录下有fastq和reference文件夹，然后运行如下命令，一定要设置-z,-p,-y这三个参数
bash /data1/spider/ytbiosoft/soft/juicer/scripts/juicer.sh -g Arg_aqu -d /data1/spider/ytbiosoft/soft/juicer -D /data1/spider/ytbiosoft/soft/juicer/CPU -z /data1/spider/ytbiosoft/test/hic_aqu/reference/genome.fa -y /data1/spider/ytbiosoft/test/hic_aqu/reference/genome_DpnII.txt -p /data1/spider/ytbiosoft/test/hic_aqu/reference/genome.chrom.size -s DpnII -t 36
输出的结果文件都在aligned目录下，其中"merged_nodups.txt"就是下一步3D-DNA的输入文件之一。
3. 运行3d-dna
3d-dna的运行也没有多少参数可以调整，如果对组装基因组质量的信心高，就用-r 0, 否则用默认的-r 2就行了。
~/soft/3d-dna/run-asm-pipeline.sh -r 2 reference/genome.fa aligned/merged_nodups.txt &> 3d.log &
然后在Juicer-Tools中对结果进行可视化，对可能的错误进行纠正。
最后输出文件中，包含FINAL就是我们需要的结果。
4.使用juicerbox进行手工纠错
关于juicerbox的用法，可以看hoptop的https://www.bilibili.com/video/av65134634
最常见的几种组装错误:
- misjoin: 切割
- translocations: 移动
- inversions: 翻转
- chromosome boundaries: 确定染色体的边界
这些错误的判断依赖于经验，所以只能靠自己多试试了。
最后输出genome.review.assembly用于下一步的分析
5. 再次运行3d-dna
根据JABT手工纠正的结果, genome.review.assembly, 使用run-asm-pipeline-post-review.sh重新组装基因组。
~/soft/3d-dna/run-asm-pipeline-post-review.sh \
-r genome.review.assembly genome.fa aligned/merged_nodups.txt &> 3d.log &
最后
假如你不小心设置了错误的-p参数，也不是特别的要紧，因为之后在最后阶段（final） 才会遇到了下面这个报错。
Could not find chromosome sizes file for: reference/genome.chrom.size
***! Can't find inter.hic in aligned/inter_30.hic
***! Error! Either inter.hic or inter_30.hic were not created
Either inter.hic or inter_30.hic were not created. Check aligned for results
即便遇到了这个报错也不要紧，因为inter.hic 和 inter_30.hic在3d-dna流程中用不到，所以不需要解决。
如果需要解决的话，有两个解决方案，一种重新运行命令，只不过多加一个参数-S final, 就会跳过之前的比对，合并和去重步骤，直接到后面STATISTICS环节。但是这样依旧会有一些不必要的计算工作，所以另一种方法就是运行原脚本必要的代码
juiceDir=~/soft/juicer
outputdir=aligned
genomePath=reference/genome.chrom.size
site_file=reference/genome_DpnII.txt
ligation=GATCGATC
# output is inter.hic
${juiceDir}/scripts/common/juicer_tools pre -f $site_file -s $outputdir/inter.txt -g $outputdir/inter_hists.m -q 1 $outputdir/merged_nodups.txt $outputdir/inter.hic $genomePath
# output is inter_30.txt
${juiceDir}/scripts/common/statistics.pl -s $site_file -l $ligation -o $outputdir/inter_30.txt -q 30 $outputdir/merged_nodups.txt
# output is inter_30.hic
${juiceDir}/scripts/common/juicer_tools pre -f $site_file -s $outputdir/inter_30.txt -g $outputdir/inter_30_hists.m -q 30 $outputdir/merged_nodups.txt $outputdir/inter_30.hic $genomePath
参考
https://www.jianshu.com/p/0969e1001d3b
https://github.com/theaidenlab/3d-dna
https://github.com/aidenlab/juicer
