任何测量都要考虑精度和通量的问题，生物测量亦如此。当测序成本受到限制时，通常需要在较大的细胞数 & 较小数据量和较小的细胞数 & 较大数据量之间进行权衡，那对于单细胞测序来讲，细胞数和测序数据量对于分析结果有何影响呢？
2016 年 Heimberg et al 开发了一个公式，评估测序数据量对测序样本区分能力的影响（测序数据量对主成分再现度的影响）。研究人员选择了 19 个不同小鼠转录组数据（平均测序数据量 107 reads），分析发现 1% 的测序数据即可有效区分样本（图 1）。具体而言，当测序数据量达到 55,000 reads/ 样本时，前三个主成分（PC1、PC2、PC3）再现度超过 80％，而若使前九个主成分均达到 80％的准确度，则需要 145,000 reads，进一步增加测序深度对主成分精度的贡献会递减。
单细胞转录组测序的核心分析内容构建细胞图谱，区分不同细胞类型，类似于 Bulk RNA-seq 中的样本 PCA 分析。为了分析测序数据对细胞类型区分的影响，Heimberg 选择了 Zeisel et al 于 2015 年发表在 Science 的文章的数据（3005 个大脑皮质和海马区细胞，15000 unique trans/cell）进行了分析。使用相同的公式，发现测序数据在1000 trans/cell 情况下，前三个主成分的再现错误率分别是 11%、22% 和 38%（图2A）。进一步验证发现，当数据量只有 100 trans/cell 时，即可有效区分少突胶质细胞和两类锥体神经元，准确度 >90％。而当数据量达到 1000 trans/cell 时，不仅可以区分少突胶质细胞和两类锥体神经元，还能够将两类椎体神经元（海马锥体神经元和皮层锥体神经元）区分开，准确度 >90％（图 2B）。
Heimberg et al 的结果表明，低测序深度情况下可以实现样本分群 / 细胞聚类。而为了进一步分析测序数据量和细胞数对细胞聚类的影响，10X 官方设置了不同测序数据量和细胞数对 PBMC 主要细胞类型检测的实验：
1、对 4000 个 PBMC 细胞测序，平均测序数据量为 50K reads/cell；
2、随机抽样设置不同测序深度：500、1K、2.5K、 5K、 7.5K、10K、 15K,、25K和 50K reads/cell；
3、随机抽样设置不同细胞数：100、200、400、600、800、1K、2K、 3K 和 4K细胞
测序深度的影响
此次评估过程采用的是 10X Genomics 单细胞转录组 V2 试剂，V2 试剂建议的最低测序数据量是 50K reads/cell，通过图 3 可知，当平均测序数据达到 50K reads/cell 时，测序饱和度、检测到的转录本数量 / 细胞、基因数量 / 细胞以及总基因数基本饱和，表明官方推荐数据量足够数据分析。
对于检测细胞数，低测序数据量（平均 506 reads/cell）和高测序数据量（平均86503 reads/cell）相差不大，检测到细胞数分别是 4273、4353，但是两种测序深度下，检测到的基因中位数差别很大，分别是 160、1234（图 4）。
尽管低测序深度时部分指标灵敏度较低，但是通过 graph-based 聚类依然推定了不同细胞亚群，t-SNE 聚类图见图 5A。基于 CD3D、CD3E 鉴定 T 细胞 ; GNLY、NKG7 鉴定NK 细胞 ; CD79A、CD79B 鉴定 B 细胞；CD14、FCGR3A 鉴定单核细胞（图 5B）。
在细胞聚类和鉴定基础上进一步分析，不同测序深度范围内，四种细胞类型（T 细胞、NK 细胞、B 细胞、单核细胞）分类准确度范围为 93-99%（图 6A、B），当测序深度达到 2.5K reads/cell 时，细胞类型分类准确度达到 98% 并且相对一致。当测序深度降低到500 reads/cell 时，相比饱和测序数据量，细胞类型分类准确度降低幅度（7%）远远低于转录本中位数 /cell（94%）、基因中位数 /cell（87%）和总基因鉴定数（33%）的降低幅度。
另 外，2019 年 发 表 在 Circulation 上 的 文 章“Single-Cell Analysis of the Normal Mouse Aorta Reveals Functionally Distinct Endothelial Cell Populations”在设计实验室 比较了不同测序深度对细胞聚类的影响，4 个主动脉样本中，2 条主动脉样本测序深度低 (17,000 reads/cell)，2 条主动脉样本测序深度高 (145,000 reads/cell)，分析得到的细胞数量二者之间无差异。
以上数据说明，单细胞转录组测序在官方推荐的数据量下（V2 试剂，官方推荐数据量 50K reads/cell；V3 试剂，官方推荐数据量 20K reads/cell），分析获得的各项指标：细胞检测数、测序饱和度、转录本、基因检测饱和度以及检测基因总数均可以达到饱和，当然考虑到单细胞悬液制备时可能会存在细胞碎片等背景干扰，占用一部分数据，可以在选择测序数据量时，对测序数据量进行加倍（例如 5000 个细胞官方推荐最低测序数据量为30G，实际测序可以测60G），但是也不需要加测太多数据，因为加测太多数据得到的收益（例如提高测序饱和度等）增幅远低于付出的测序成本。
细胞数量的影响
为了评估捕获得到的细胞数对细胞类型分类准确性的影响，在每个读取深度基础上按照 100-4000 个细胞进行二次取样。在测序深度为 50K reads/cell 时，不同细胞数量下细胞类型分类准确性范围为 82-99％（图 6C）。当细胞数是 1000 时，精确度变化幅度为10％（87-98％），而在 100 个细胞时，准确度估计值为 55-92％，表明随着细胞计数的减少，细胞分类准确度变异性增加。综合测序数据量和细胞数，可知在低细胞数情况下，随着测序深度增加，细胞类型分类准确度依然维持在较低水平，但在低测序深度情况下，细胞类型分类准确度可以随细胞数量增加而增加，表明细胞数对细胞类型分类准确度的影响大于测序深度。
参考文献
Heimberg, G., Bhatnagar, R., El-Samad, H., & Thomson, M. (2016). Low Dimensionality in Gene Expression Data Enables the Accurate Extraction of Tranional Programs from Shallow Sequencing. Cell Systems, 2(4), 239–250. doi:10.1016/j.cels.2016.04.001.
Kalluri, A. S., Vellarikkal, S. K., Edelman, E. R., Nguyen, L., Subramanian, A., Ellinor, P. T., … Gupta, R. M. (2019). Single Cell Analysis of the Normal Mouse Aorta Reveals Functionally Distinct Endothelial Cell Populations. Circulation.doi:10.1161/circulationaha.118.038362.
