影响因子：5.8

研究概述：

骨关节炎(Osteoarthritis, OA)是一种退行性炎症性关节疾病，是致残的主要原因，以长时间活动后的关节疼痛和僵硬为特征；Anoikis为失巢凋亡，是一种发生于细胞外基质(ECM)丢失或细胞与ECM之间存在破坏时的程序性凋亡。

骨关节炎（OA）与失巢凋亡（Anoikis）密切相关，本研究旨在通过机器学习和单细胞分析等手段，重点探索失巢凋亡相关基因在OA的发生、发展和治疗中的表达水平，并探索新的基于转录组的失巢凋亡相关生物标志物和 OA进展的通路。

关于非肿瘤生信，我们也解读过很多，主要有以下类型
1 单个疾病WGCNA+PPI分析筛选hub基因
2 单个疾病结合免疫浸润，热点基因集，机器学习算法等
3 两种相关疾病联合分析，包括非肿瘤结合非肿瘤，非肿瘤结合肿瘤或者非肿瘤结合泛癌分析
4 基于分型的非肿瘤生信分析
5 单细胞结合普通转录组生信分析

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流程介绍：

作者首先在GEO数据库下载数据集GSE114007和GSE89408，从 GeneCards 数据库中收集了与 Anoikis 相关的一系列基因。接着鉴定出37个Anoikis 相关差异表达基因 （DEARGs）。采用Lasso回归分析鉴定出 10 个 DEARGs，并以此区分了两个失巢凋亡亚型，进行免疫浸润分析。

随后作者对A、B两个失巢凋亡亚型进行差异分析，发现了 1844 个DEARGs，并采用共识聚类的方法将OA患者分为基因亚组A和基因亚组B，进而进行免疫浸润和生物学功能分析。

在疾病WGCNA分析中发现MEgreen模块，在基因亚组WGCNA中发现MEturquoise模块最为显著。利用XGB、SVM、RF和GLM模型鉴定了5个枢纽基因（CDH2、SHCBP1、SCG2、C10orf10、PFKFB3），使用这5个基因构建的诊断模型在训练和验证队列中表现良好。最后使用数据集GSE152805在单细胞水平上分析OA。

研究结果：

一、失巢凋亡相关基因的表达图谱

1. 在正常组和OA组之间的火山图中显示了756 DEGs（图2A)。作者在756个DEGs和513个失巢凋亡相关基因之间的维恩图中，鉴定出37个失巢凋亡相关差异表达基因（DEARGs）(图2B)。

2. 图2C的热图可视化了37个DEARGs，许多基因在OA样本中高表达，包括IGF1、TUBB3、THY1、MMPP11、EGF、CDH2、EDA2R、SPP1、EZH2、CENPF、BUB1、S100A4、TNC、HTRA1、MMP3、CXCR4、PLAU、ITGA4、TIMP1、CDCP1和PIK3CG等21个基因。

3. 同时对37个DEARGs的染色体位置进行可视化(图2D)。为研究这些DEARGs之间的相互作用，作者进行了相关分析，发现CENPF与BUB1之间高度正相关(图2E)。

二、鉴定失巢凋亡亚型

1. 采用Lasso回归分析，从37个DEARGs中获得10个基因作为潜在的OA生物标志物（图3A，B)。

2. 作者基于10 个DEARGs的表达，使用共识聚类算法进行无监督聚类以识别失巢凋亡相关亚型。将k的值设置为1–9，结果表明，k=2是根据10 个 DEARGs将42份Oa样本分为A和B亚型的最佳参数（图3C-F)。

3. 主成分分析（PCA）结果显示A亚型和B亚型之间有明确的区别（图3G)。

三、两种失巢凋亡亚型的免疫浸润具有不同的特征

1. 图4A的火山图显示了两种失巢凋亡相关亚型之间的DEGs。图4B是28 种免疫细胞表达热图，显示两亚型之间存在差异，如浆细胞样树突状细胞和中央记忆 CD4 T 细胞在 B 亚型中表达较高。

2. 条形图显示了28个免疫细胞的不同比例，巨噬细胞M0和浆细胞占比很大（图4C)。基因集变异分析（GSVA）显示，糖胺聚糖生物合成硫酸乙酰肝素和糖胺聚糖生物合成硫酸软骨素在A亚型中高表达，B亚型主要富集戊糖和葡萄糖醛酸相互转化（图4D)。

3. GO分析显示，1844个与失巢凋亡相关亚型的DEGs在BP的骨化、CC的含胶原的细胞外基质、MF的核苷三磷酸酶调节剂活性和GTP酶调节活性中富集（图5A）。GO分析的圆图（图5B)及KEGG条形图和气泡图（图5C，D 包括前20个KEGG项）显示：PI3K-Akt信号通路和钙信号通路主要在KEGG分析中富集。

4. 作者探索了两个亚型的25个免疫检查点，共有9个免疫检查点基因具有显著性（图5E)。为确定两种亚型之间的潜在过程和通路，作者使用GSEA进行了KEGG通路富集分析：包括组氨酸代谢、丙酸代谢、核糖体、RNA降解和泛素在内的多种免疫相关通路主要富集于A亚型（图5F)。而轴突引导、基底细胞癌、ECM受体相互作用、局灶黏附和Notch信号通路等通路主要富集于B亚型（图5G)。

5. B亚型中的活化B细胞、活化CD4 T细胞、活化CD8 T细胞、CD56dim自然杀伤细胞、自然杀伤T细胞、浆细胞样树突状细胞和17型辅助性T细胞水平显著高于A亚型（图6A)。相关性分析显示28个免疫细胞与OA存在相关性：巨噬细胞与髓源性抑制细胞的正相关性最高，未成熟树突状细胞与活化B细胞的负相关性最高（图6B)。

6. 图6C计算了A、B两亚型所有骨关节炎患者的 10 个基因特征和 28 种免疫细胞类型之间的相关性：2型辅助性T细胞和活化CD4 T细胞与THY1基因呈负相关，单核细胞与TIMP1基因呈正相关。

7.，A亚型中CCR、检查点和T细胞共刺激水平较高，B亚型中aDCs、中性粒细胞、Th1_cells和Th2_cells水平较高（图6D)。aDCs与MMP11的相关性最高且呈负相关，APC共刺激与TIMP1基因呈正相关（图6F)。

四、基于失巢凋亡亚型DEGs的基因亚组鉴定

1. 为验证失巢凋亡亚型，作者对A、B亚型进行差异分析，共发现了 1844 个DEARGs。基于此，作者采用共识聚类的方法将OA患者分为基因亚组A和基因亚组B（图7A)。图7B显示每个聚类之间关系的项目共识图。从图7CD可见，共识评分在理想分组为 K = 2存在最大值。

2. 图7E是基于基因亚组的 28 个免疫浸润热图，表明激活 CD8 T 细胞和激活 CD4 T 细胞在基因亚组A中水平较高。

五、两个基因亚组的免疫浸润和生物学功能具有不同的特征

1. 根据基因亚组，图8A的条形图将 28 个免疫细胞的不同比例可视化。幼稚B细胞、M0巨噬细胞和浆细胞在条形图中占有很大比例。作者在两个基因亚组之间进行GSVA，发现Notch信号通路和碱基切除修复在A亚组中上调，而戊糖和葡萄糖醛酸互转化和其他聚糖降解在B亚组中下调（图8B)。

2. 图8C的冲积图显示，失巢凋亡亚型和基因亚组之间的分布和关系相似：活化B 细胞和 2 型辅助性T细胞在基因亚组 B中的水平较低，而活化的CD4 T细胞和自然杀伤细胞在基因亚组 B 中的水平较高（图8D)。

免疫相关通路的比较：T细胞共抑制和T细胞共刺激在基因亚组A中更高，而Th2细胞和Treg在基因亚组B中更高（图8E)。

3. 相关图显示10个基因与免疫细胞和通路之间存在显著相关性：VEGFA基因与未成熟B细胞呈负相关，MMP11基因与CD56dim自然杀伤细胞呈正相关（图8F)。VEGFA基因与巨噬细胞呈负相关，THY1基因与CCR呈正相关（图8G)。

六、37种失巢凋亡相关差异表达基因（DEARGs）在不同组中的表达

1. OA样本中的大多数基因高于正常样本。然而DAPK2、FASN、ITGB4、ITPRIP、JUP、LTB4R2、MAOA、PAK3、PDK4、PTK6、RAC3、RHOB、SESN2、SIK1和VEGFA在OA样品中的表达较低（图9A)。

2. 根据失巢凋亡亚型绘制37个DEARGs的箱线图，可见VEGFA、PLAU、FASN、TNC、TUBB3、TUBB3和MMP11在失巢凋亡B亚型中的表达水平较低，而EGF、MAOA 和 PDK4 在失巢凋亡B亚型中的表达更高（图9B)。

2. 比较两基因亚组间37个DEARGs的表达，HTRA1、BUB1、HK2、S100A4、MMP3和PDK4等在基因亚组A中的表达水平较低，而VEGFA、FASN、JUP、TIMP1、SIK1、ITGB4、THY1、PTK6和MMP11在基因亚组A的表达水平较高（图9C)。

因此得出结论：DEARGs在OA样本中的表达较高，而且有更多的基因在失巢凋亡B亚型和基因亚组B的表达水平较高。

七、枢纽基因的鉴定和列线图的构建

1. 基因亚组的WGCNA分析将MEturquoise模块鉴定为枢纽模块，包含1192个基因（图10A)。在疾病WCNA分析中，MEgreen模块为最显著模块，包含239个基因（图10B)。维恩图显示了基因亚组 WGCNA 和疾病 WGCNA 分析之间的 114 个交叉基因（图10C)。

3. 综上作者确定XGB模型为最佳模型，将XGB模型的前5个基因确定为枢纽基因（CDH2、SHCBP1、SCG2、C10orf10和PFKFB3）。作者构建了基于枢纽基因的列线图模型，以探索疾病风险（图11A)。

4. 利用校准曲线对列线图模型进行评价，可见5个枢纽相关基因与理想模型吻合较好（图11B)。DCA曲线显示，基于列线图的决策可能有益于OA患者，且列线图模型比单个ARG具有更高的临床效用（图11C)。

5. 最后作者使用五个枢纽基因，从合并的数据集中构建单独的ROC曲线和完整的ROC曲线 （图11D，E)。5个枢纽基因的箱线图显示，C10orf10和PFKFB3在OA样本中的表达低于正常样本，CDH2、SCG2和SHCBP1在OA样本中的表达高于正常样本（图 11F)。热图显示5个枢纽基因的表达情况（图11G）。

6. 使用GSE55235数据库验证枢纽基因的表达。GSE55235中枢纽基因的箱线图和热图与合并数据集中的箱线图和热图相同（图11H，I)。

八、ceRNA的构建与免疫浸润相关性分析

1. 作者构建了lncRNA-mRNA-miRNA网络，有大量lncRNA和miRNA受到五个枢纽基因的调控（图12)。IncRNAs和SNHG14的has-miR-30b-3p、has-miR-149-3p和has-miR-515-5p，以及lncRNAs的MUC2与枢纽失巢凋亡相关基因密切相关。该网络有助于探索骨关节炎的潜在机制，并为后续的治疗策略提供方向。

2. 作者还对 5 个枢纽基因和 28 个免疫浸润细胞进行了相关性分析（图13A)。结果表明：

C10orf10与活化B细胞的关系最强，与活化的树突状细胞呈负相关；

CDH2与未成熟树突状细胞呈正相关，与活化B细胞呈负相关；

PFKFB3与活化B细胞的相关性最高，与活化的树突状细胞呈负相关；

SCG2 在调节性T细胞中呈最高阳性，在活化B细胞中呈最高阴性；

SHCBP1与调节性T细胞的正相关关系最强，与活性B细胞的正相关关系相反。

综上所述，这些枢纽基因很可能参与OA发病过程中的免疫调节。

九、单细胞分析：失巢凋亡与OA软骨中的免疫相互作用

1. 从GSE152805数据集中获得6个OA样本的25852个细胞的基因表达谱(图14A)。nCount_RNA与nFeature_RNA呈正相关（图14B)。方差图显示所有细胞中有 30,738 个基因，红点代表前 2000个高度变异的基因（图14C)。

2. 采用24个鉴定的标记基因在不同亚群中显示并鉴定出相应的细胞类型（图14D)。作者共发现14个独立的亚群，并建立了7 种细胞类型（HomC、RepC、HTC、preFC、FC、preHTC 和 RegC）（图14E，F)。特征图和小提琴图显示了5个ARG枢纽基因在各种细胞类型中的分布：C10orf10和BFKFB3的表达高于其他免疫细胞类型（图14G，H)。

3 图15通过CellChat推断细胞间通信，揭示了全局信号变化。

（A-B）每种软骨细胞亚型之间细胞相互作用数量和相互作用强度的圆图。

（C）OA软骨中每个簇的细胞类型之间的串扰分析。

（D）与每个簇的细胞类型相关的基因的表达。

（E）OA软骨簇中7种细胞亚型的相对强度 （F）不同簇在SPP1信号通路中的作用重要性。（G）与SPP1信号通路相关的基因的表达水平。

（H）圆图显示了 SPP1 信号通路介导的细胞通讯的明显变化。OPA软骨中的SPP1信号水平增强，pre-FC为信号通信中心。

本文采用机器学习和单细胞分析方法筛选出5个与失巢凋亡相关的枢纽基因（CDH2、SHCBP1、SCG2、C10orf10和PFKFB3）和免疫相关细胞。利用ceRNA对枢纽基因的开发可为探索OA的机制提供相应的lncRNA和miRNA，关键基因为OA的免疫治疗提供潜在的靶点。本研究可能为研究Anoikis相关基因与OA的关系提供新的见解。