本次分享的文献是microRNA-Dependent Modulation of Genes Contributes to ESR1’s Effect on ERα Positive Breast Cancer，2020年5月发表在Front Oncol杂志上，影响因子4.848。文章重点研究ESR1基因在ERα阳性乳腺癌中的分子机制，着重使用了网络分析来构建分子调控机制！
01-研究流程图
02-结果
1.筛选Luminal a型乳腺癌 and Luminal B型乳腺癌的DE-miRNAs和DE-mRNAs
为了研究ERα阳性乳腺癌中ESR1介导的miRNA分子调控机制，本文选取了GSE38280数据集中包含的4例Luminal a型和Luminal B型乳腺癌数据作为研究对象。首先，测定乳腺癌标本中ESR1的表达水平（图1A、B）。与4例Luminal B型乳腺癌患者相比，4例Luminal a型乳腺癌患者的ESR1表达明显上调。同时检测ESR2的表达（图1C），两组之间无显著差异。此外，在乳腺癌分子亚型分类中另外三个关键分子（PGR、ERBB2和MKI67）的表达值分别如图1D-F所示。接下来，使用数据集GSE38280的miRNAs子数据集GSE38278，利用在线工具GEO2R识别luminal A和luminal B乳腺癌之间的DE-miRNAs，共获得74个显著的DE-miRNAs，包括19个上调的DE-miRNAs和55个下调的DE-miRNAs（图1G）。随后，对数据集GSE38280的mRNA亚数据集GSE38279进行差异表达分析，进一步筛选了Luminal a型和Luminal B型乳腺癌的DE-mRNAs（图1H），最终获得359个显著上调的DE-mRNAs和471个显著下调的DE-mRNAs。通过miRNet数据库，预测了74个DE-miRNAs的潜在靶基因。最终预测这些DE-miRNAs共有8855个靶点。为了确定候选的DE-mRNAs，作者将这些靶基因和显著的DE-mRNAs取交集。312个DE-mRNAs用作后续分析（图1I）。
图1
2. 功能注释、通路富集和蛋白质相互作用（PPI）分析
为了更好地了解这些候选DE-mRNAs基因，作者首先利用Enrichr数据库进行GO（图2A-C）和KEGG（图2D）富集分析。接下来，将这些候选的DE mRNAs映射到STRING数据库中进行PPI分析。利用Cytoscape软件（3.6.1版）根据节点度来识别PPI网络中的hub基因。如表2所示，筛选出节点度≥10的前51个hub基因。为了更好的可视化，作者重新构建了前51个hub基因的亚PPI网络（图2E）。选择这些hub基因进行后续分析。
图2
3. ERα阳性乳腺癌Hub基因的生存分析
接下来，作者使用Kaplan-Meier绘图仪数据库评估了51个hub基因在ERα阳性乳腺癌中的预后价值。如图3所示，51个hub基因中的27个在ERα阳性乳腺癌中具有显著的预后作用，说明27个hub基因可能是调节ERα阳性乳腺癌的关键基因。
图3
4. 鉴定ERα阳性乳腺癌中一个潜在的miRNA网络
从ERα阳性乳腺癌中筛选出27个具有显著预后价值的hub基因，构建miRNA-mRNA网络。这27个hub基因在luminal B型乳腺癌中显著上调。基于miRNAs对下游靶基因的负调控机制，27个hub基因的上游miRNA在luminal B型乳腺癌中应表达下调。在所有潜在的27个miRNAs中，26个miRNA的表达水平在luminal B型乳腺癌显著降低。STRING+Cytoscape得到的26个miRNA 的72个miRNA-mRNA关系对的可视化网络图如图4所示。
图4
5.ERα阳性乳腺癌候选miRNA的生存分析
基于TCGA和METABRIC数据库，利用Kaplan-Meier绘图仪确定了26个miRNA在ERα阳性乳腺癌中的预后作用（图5A、B）。通过结合TCGA和METABRIC数据库中有良好预后的miRNA，取二者交集（图5C）。在TCGA和METABRIC数据库中出现了7个对ERα阳性乳腺癌具有良好预后作用的miRNA。hsa-let-7a5p、hsa-let-7c-5p、hsa-miR-30a-5p、hsa-miR-29c-3p、hsa-miR10b-5p、hsa-miR-195-5p和hsa-miR-497-5p的生存曲线如图5D-J所示。选择7个miRNAs及其相应的下游靶向hub基因进行接下来的分析。
图5
6. ERα阳性乳腺癌ESR1介导miRNA调控网络的建立
随后，作者对ESR1与7个miRNA之间进行了相关性分析。在ERα阳性乳腺癌中，ESR1的表达与hsa-let-7a-5p（图6A）、hsa-let7c-5p（图6B）、hsa-miR-30a-5p（图6C）、hsa-miR-29c3p（图6D）、hsa-miR-10b-5p（图6E）、hsa-miR-195-5p（图6F）和hsa-miR-497-5p（图6G）呈正相关。接下来，作者想确定ESR1是否是7个潜在miRNAs的上游调节因子。这里选择MCF-7和T47D作为ERα高表达的两个具有代表性的细胞系。在MCF-7和T47D细胞中使用ESR1 siRNA后，ESR1表达显著下调（图6H）。正如预期的那样，在MCF-7（图6I）和T47D（图6J）中ESR1基因敲除后，7个潜在miRNA的表达水平显著降低。紧接着作者评估了ERα阳性乳腺癌中7个潜在miRNA及其靶点的表达关系（图7A-I）。此外，作者还确定了ERα阳性乳腺癌中miRNAs和靶hub基因的上下游关联。在MCF-7和T47D细胞中首次检测到miRNA模拟物的过度表达效应。如图7J，K所示，分别使用MCF-7和T47D中的miRNA模拟物显著上调了7个miRNA。除了hsa-let-7a-5p-CCNB2和hsa-miR-30a-5p-MYBL2对外，在MCF-7（图7L）和T47D（图7M）中过度表达7个miRNAs后，这7个miRNAs的潜在靶向hub基因的表达水平显著下调。考虑到所有这些发现，构建了ESR1介导的miRNA调控网络，如图8所示。最后，18个ERα阳性乳腺癌组织被用来验证ESR1 -miRNA、miRNA-mRNA和ESR1- mRNA对之间的关系（图9）。在ERα阳性乳腺癌中，ESR1表达与miRNA表达呈正相关，miRNA表达与mRNA表达呈负相关，ESR1表达与mRNA表达呈负相关。在这些配对中，只有hsa-miR-497-5p/CCNE1对没有统计意义（图9M），这也进一步支持了之前的生物信息学分析。
图6
图7
图8
图9
03-结语
ERα阳性乳腺癌的内分泌治疗耐药性和转移是ESR1失调的原因。因此，本文重点研究了ESR1基因在ERα阳性乳腺癌中的分子调节机制，所用到的方法主要是网络分析（STRING+Cytoscape）。想研究单基因在某种癌症中作用机制的朋友可以借鉴一下这篇文章！
