这次是分享李婧翌团队的一篇综述《Modeling and analysis of RNA-seq data: a review from a statistical perspective》，从统计学的角度理解RNA-seq的分析
分析的方向
目前正对RNA-seq的数据主流的有4个方向（当然事实上不止这些，可以辛苦读者慢慢收集整理，欢迎与我讨论）
- 基因sample-level，这里主要是看生物学处理间，基因表达模式的相似性，通常用Pearson或Spearman相关系数进行表示
- Gene-level，这里涉及到基因表达的定量
- Transcript-level，这里涉及到对不同转录本的定量
- Exon-level，这里涉及到差异可变剪切的检测
接下来作者主要围绕这四块内容进行在统计学上的理解
1). Sample-level
基于sample的分析，目的是检测不同sample的表达模式的相似性，通常可以利用Pearson and Spearman correlation coefficients来衡量。如果是利用全部基因来计算相关系数，管家基因的存在势必会 "夸大" 相关系数，因此比较好的方法是利用相关基因而不是全部的基因来计算，而R包TROM就是用来解决这类问题的，TROM通过计算TROM分数来选择出相关基因后，进行sample间相关系数的计算
除了计算相关系数，我们可以利用非线性的方法t-SNE或UMAP来进行降维聚类，以观测样本间的相似性
2). Gene-level
Gene层面的研究主要是对基因进行定量，并且进行差异表达分析，差异表达分析基本统计学模型的假设为，某个基因的count（表达量）在各个sample中的分布服从泊松分布或者负二项分布（如果是log以后的值一般认为服从正态分布）：
其中：
- Yk,ij 代表的是 condition k 中第 j 个sample gene i 的表达量
- Skj 代表 condition k 中第 j 个sample 的size factor
- θki 代表 condition k 中 gene i 的真实表达水平（可理解为在 condition k 的条件下， gene i 在各个 sample 中的平均表达水平）
- Φi 表示 gene i 的dispersion
其基本假设为：
上图表示某个基因A在所有sample中表达量的分布（但由于生物学的sample较少，所以统计学家往往直接利用负二项分布去拟合），均值为Skjθki
经过统计学检验两个分布的差异，显然该基因在condition 2的表达量要小于condition 1中的，p值的计算可以考虑用置换检验来从两个分布中抽样计算p值
另外一种就是基于的共表达分析：
其中：
- Aij 代表gene i 与 gene j 的相关性矩阵
- k 代表 gene k
- dij = 1 - Tij，用于表征基因之间的相似性距离
2). Transcript-level
一个基因可能有不同的转录本，基于转录本水平的分析主要是对一个基因的不同转录本进行定量
而对转录本定量往往存在一个问题，那就是对于同一个基因来说，一部分转录本的序列有overlap，那么reads在比对回去的时候，很难区分这些reads到底来自哪一个转录本，因此统计学家往往采用EM算法进行转录本的定量
并作出如下定义：
θj 表示 reads 来自于 isoform j 的概率
定义isoform的集合为：{ 1，2，3，.....，J }
Region based：
假设 X={ Xs | s∈S }，Xs代表map到region s上总的reads数，假设map到region s上总的reads数服从λs的泊松分布：
这里假设参数λs满足线性关系：
假设如下例子：
一共有三个isoform，这里的 Xs 特指map到外显子上的reads，而该例子中一共有4个外显子，Xs = Xs1 + Xs2 + Xs3 + Xs4
对于每一个转录本来说，如果该转录本缺乏某一个外显子，那么这个外显子上的reads数为0，似然函数：
相应的外显子区域的多项式值为 1（相当于没有贡献），利用极大似然估计的思想，我们的目的是确定似然函数 L() 取得最大值的时候参数 λs 的值，而 λs与θj满足线性关系**，即确定 λs 后利用EM算法对 θi 进行分配，原理参见：《用简单的EM算法模型理解RSEM算法》
经过计算后，我们可以得到：例如 θ1=0.37，θ2=0.33，θ3=0.3，相当于一共有100条reads分配到该区域（该基因），isoform 1 表达37条，isoform 2 表达33条，isoform 3 表达30条
Reads based：
基本模型如下：
这种模型的基本思想是计算 reads i 来自于 isoform j 的概率，根据条件概率公式，
表征同时选中 reads i 和 isoform j 的概率，也就是定量结果
Regression-based：
回归的方法和 Region based 的方法理解相似，只不过 Region based 利用极大似然的方法估计参数；而 Regression-based 基于最小二乘的思想求解参数
4). Exon-level
这一块主要分析的是可变剪切事件，那么可变剪切事件的PSI定义为：
其中：
- CI denotes the number of reads supporting the inclusion isoform
- CE denotes the number of reads supporting the exclusion isoform
- LI and LE denote the lengths or the adjusted lengths
而可变剪切的统计学模型是：
例如 inclusion 事件的reads的分布满足于总reads数为 n = CI + CE，reads属于 inclusion 的概率为 ψ（PSI）的二项分布（均值μ = n×p），而判断差异可变剪切事件为：
构建不同condition的二项分布，对于某个基于来说
经过统计学检验两个分布是有差异的（CIk的分布是有差异的），因而判断为差异可变剪切事件
经过统计学检验两个分布是没有差异的（CIk的分布是没有差异的），因而判断为非差异可变剪切事件
