在探究功能基因的时候，我们经常需要对所研究的基因/蛋白质进行聚类分组，逐个类群探究蛋白功能。创建同源群可以采用Otrhofinder软件，该软件安装方便，运行快速，调用简单，可以说是构建同源群的神器。从OrthoFinder2.4.0版本开始，同源群的划分给予有根树的层次，这种划分方法比依靠相似度要更加准确。此外，如果在推断的过程中添加了外群物种，分群的精度有望进一步提升[1]。
OrthoFinder 工作流程
- 调用 DIAMOND 对输入序列进行 all-vs-all 序列比对。diamond搜索速度快，非常适用于大量基因的相似度比对。
- 使用 MCL（Markov Cluster Algorithm） 算法根据比对结果进行聚类，得到直系同源组（orthogroup）。其中每个 orthogroup 的蛋白及序列信息存放在 Orthogroup_Sequences 文件夹中，单拷贝 orthogroup 的蛋白及序列信息存放在 Single_Copy_Orthologue_Sequences 文件夹中，orthogroup 的统计信息存放在 Comparative_Genomics_Statistics、Orthogroups 文件夹中。
- 使用 FastMe 对每个 orthogroup构建无根基因树（gene tree）。
- 使用 STAG（Species Tree Inference from All Genes） 根据刚刚划分好的包含所有物种的orthogroups中的同源基因推断无根物种树（species tree），此处会综合考虑每一棵OG内基因构建的基因树，汇总成为最终的物种树。通过参数 -M dendroblast 或 -M msa，OrthoFinder 可以调用 STAG 中两种构建物种树的方法：DendroBLAST 和 CMSA（Concatenated Multiple Sequence Alignment，联合多序列比对）。
- 使用 STRIDE（Species Tree Root Inference from Gene Duplication Events） 通过基因复制事件的不可逆性为无根物种树、无根基因树赋根，得到有根物种树、有根基因树、基因间的直系同源关系、基因复制事件。结果存放在文件夹 Species_Tree、Gene_Tree、Orthologues、Gene_Duplication_Events、Comparative_Genomics_Statistics 中。
1.创建环境并安装orthofinder
conda create -n ogsfinder python=3.9.15 #太高版本的python，例如3.11在后面会报错。
conda activate ogsfinder
conda install -c bioconda orthofinder diamond=2.1.8 #错误的diamond版本会报错。
2.运行orthofinder寻找直系同源基因
将待寻找OGs的多个蛋白质组文件存放于ExampleData文件夹，运行orthofinder命令。指定运行占用20个cpu（默认使用16个cpu）。此处添加参数-M msa会进行bootstrap检验，最终看到的物种数是具有bootstrap值的。
orthofinder -f ExampleData -S diamond -t 20 -M msa
#-t 并行序列搜索线程数（默认= 16）
#-a 并行分析线程数（默认值= 1）
#-M 基因树推断方法。可选：dendroblast和msa（默认= dendroblast）推荐msa，可执行带有bootstrape的建树
#-S 序列搜索程序（默认= blast）选项：blast，mmseqs,，blast_gz，diamond（推荐使用diamond，比对速度很给力）
#-A 多序列联配方式，需要添加参数-M msa时才有效；（默认= mafft）可选择：muscle，mafft
#-T 建树方法，需要添加参数-M msa时才有效，（默认 = fasttree）可选：iqtree，raxml-ng，fasttree，raxml（推荐）
但是如需在构建物种树里加入bootstrape值则需要进入程序的config.json文件修改对应建树软件的e值或者新增-b 1000/-bb 1000。
运行结束后会在ExampleData目录下生成新的目录OrthoFinder。
参考信息：
- Github OrthoFinder https://github.com/davidemms/OrthoFinder#getting-started-with-orthofinder
- orthofinder安装及使用教程 https://www.jianshu.com/p/3bcd965605f5
