Moritsuka E, Chhang P, Tagane S, et al (2017) Genetic variation and population structure of a threatened timber tree Dalbergia cochinchinensis in Cambodia. Tree Genet Genomes 13:115. doi: 10.1007/s11295-017-1199-8

摘要

黄檀（Dalbergia cochinchinensis Pierre de Laness） （豆科植物）是东南亚商业上重要的树木。尽管该物种受到法律保护，但非法采伐和无序开发已经减少了其种群，目前对该物种的保护非常关注。在这项研究中，我们确定了柬埔寨D. cochinchinensis四个种群中六个叶绿体和十个核心位点的核苷酸序列，然后进行了群体遗传分析。核基因座上的平均沉默核苷酸多样性（不包括具有特别高值的核苷酸）在整个群体中为0.0057，并且每个群体对之间的核基因座上的平均FST在0.135和0.467之间。因此，与其他树种相比，研究群体中的核苷酸多样性并不低，并且群体分化水平很高。中立性检验统计数据表明最近群体规模减少，并且该物种内的群体细分。假设使用迁移模型进行隔离，使用基于可能性的方法估计发散时间和迁移率。根据结果，这三个种群在68,000 - 38，000年前分裂，可能对应于最后一个冰期的开始，此后种群间的基因流动水平非常低。此外，分裂后，群体规模大大减少。值得注意的是，核C4H的非编码区中的插入序列中的核苷酸多样性远高于其他核基因的沉默位点中的平均核苷酸多样性，表明该区域受选择的影响。

介绍

为了保护物种的遗传多样性和/或了解物种的进化，我们必须了解该物种种群的历史，包括种群的分裂和混合，迁徙以及种群大小的变化，因为当前的遗传状况是物种由以前的种群结构塑造。随着基于可能性的方法学的最新进展，可以从DNA数据推断种群的历史（参见，例如，Nielsen和Beaumont 2009）。 DNA序列多态性在这些方法中特别有用，因为核苷酸变化的速率和模式在某种程度上是已知的，这是计算推断所必需的观察到的遗传变异的可能性所必需的。
在这项研究中，我们使用核和叶绿体的DNA序列数据，研究了豆科植物中的暹罗红木，黄檀（Dalbergia cochinchinensis Pierre ex Laness）的柬埔寨种群的历史，这是全球豆科植物多样性评估的目标（Yahara等，2013）。Dalbergia L.属包括大约250种乔木，灌木和藤本，广泛分布于世界各地的热带和亚热带地区（Lewis等2005）。该属是昆虫的，偶尔通过根吸盘繁殖，并通过灌输再生。种子通常是扁平的，用于风散。由于该物种与共生的固氮细菌有关，因此这些植物可用于土壤改良和重新造林（So 2011）。此外，一些种类的黄檀，特别是D. cochinchinensis，以木材的良好颜色而闻名，产生了良好的香气，美丽的木纹和各种颜色。此外，由于木材坚硬，耐用并且耐白蚁，所以D. cochinchinensis用于高档家具，乐器和艺术工艺品等用途，因此具有商业重要性（Soonhuae 1994）。 D. cochinchinensis广泛分布于东南亚印度支那半岛的柬埔寨，老挝，泰国和越南国家的低地混合落叶或干燥常绿森林中（Niyomdham等1997）。然而，在木材采伐的高压下，D. cochinchinensis的种群被分割成许多亚种群，每个亚种群仅由少数个体组成，并且很少见到能够产生花/果实的大树。因此，许多国家已经禁止伐木，并且1998年IUCN红色名单版本2.3将D. cochinchinensis评级为易受伤害（VU）（IUCN 2013）。然而，由于该物种的木材和文物以高价出售，非法采伐继续迅速减少个人/群体的数量。
由于这些保护问题，使用泰国的等位酶标记（Soonhuae 1994），泰国和老挝叶绿体基因座的核苷酸序列（Yooyuen等2012）和随机扩增多态性DNA（RAPD）进行了D. cochinchinensis的群体遗传分析。和越南的简单序列重复（ISSR）标记（Hien和Phong 2012）。这些研究表明，该物种的种群内部和之间存在大量的遗传变异。然而，由于这些标记的分辨率低，并且在输入一些标记时存在不确定性，因此尚未对D. cochinchinensis种群的历史进行推断。
在这项工作中，我们对来自三个柬埔寨省的四个D. cochinchinensis种群的48个个体中的六个叶绿体和十个核基因进行了测序。除了量化群体之间和群体内的变异之外，我们使用基于可能性的方法在IMa2（Hey 2010）中实现，以推断这些群体的历史，假设Hey和Nielsen（2004）的迁移（IM）模型的隔离。群体的分割时间估计为68,000？38,000年前，估计祖先种群的规模远大于现有种群的规模。此外，我们发现核基因座具有非常高水平的核苷酸多样性。

材料和方法

样品

为了推断种群的历史并找到候选基因座以供选择，我们需要准确的序列数据。因此，尽管使用下一代测序仪（NGS）的高通量遗传分析已经变得流行，但我们仍然进行Sanger测序，因为我们必须高精度地检测局部单体突变。【言外之意，桑格的精度高于NGS】
这与亚克隆确定单倍型的偶然必需品一起，将测序的等位基因总数限制为小于每个基因座约100个。此外，为了使用中性统计检测选择，我们需要来自每个群体的20个或更多等位基因（Simmonsen等1995）。考虑到我们观察到的多态性水平，我们决定使用来自少数群体的十个或更多个体进行分析。虽然D. cochinchinensis分布在柬埔寨境外，但推断密切相关种群的历史是了解整个种群历史的第一步。
因此，在四个种群的四个地点收集了D. cochinchinensis的叶样品：一个在暹粒省（SR），一个在Kampong Thom省（KT），两个在Kampot省（KM1和KM2）。群体之间的距离为180公里（SR-KT），348公里（SR-KM1），356公里（SR-KM2），258公里（KT-KM1），250公里（KT-KM2）和32公里（KM1- KM2）。样品位置如图1所示。样品信息总结在补充材料表S1和S2中。我们从SR中的24棵树，KT中的15棵树，KM1中的37棵树和KM2中的26棵树中采集了一些叶片。用硅胶干燥叶子。采样树分开至少3米。然而，一些树在所有叶绿体和核基因座上共享相同的基因型（补充材料表S2）。我们认为这些树是克隆，可能是由附近树上的根吸盘产生的。因此，在以下分析中选择这些树中的一个作为克隆的代表。例如，在KM1中，在7个站点（每个站点1到16个人）收集了37棵树的叶子。这些遗址距离彼此超过一百米，但遗址内的树木彼此接近。因此，同一地点的所有树木都具有相同的基因型。因此，我们从每个站点中选择了一棵树，并使用来自七棵树的叶子来分析KM1。同样，在KM2和SR中都选择了13棵树。在KT中，所有树木对至少在一个位点具有不同的基因型;因此，使用了所有15棵树。由于KT中的树木比其他三个种群更丰富，我们可以在KT中更加分开地对树木进行采样。总共使用48个D. cochinchinensis样品进行分析。此外，对来自Kampong Thom省的四个黄檀（Dalbergia nigrescens Kurz）个体进行取样并用作外群，并对在暹粒省相同的部落Dalbergieae中的一个Pterocarpus macrocarpus Kurz个体进行取样并用于估计核苷酸取代率。使用CTAB方法（Murray和Thompson 1980）从干燥的叶组织中提取总基因组DNA。

引物设计

用于被子植物的通用引物用于六个叶绿体基因座：rbcL（Levin等2003; Kress和Erickson 2007），matK（Dunning和Savolainen 2010），trnS-trnG（Hamilton 1999），trnV-trnM（Demesure等1995） ，trnLintron（Taberlet等1991）和trnC-petN（Demesure等1995; Lee和Wen 2004）。当由于长均聚物而无法确定序列时，设计了额外的测序引物以避免含有均聚物的区域。
基于从NCBI数据库获得的序列信息设计10个核基因的PCR引物。基因的信息显示在补充材料表S3中。简而言之，引物按以下步骤设计：首先，用可用于两种以上豆科植物的DNA或RNA序列搜索基因。 比对这些基因的序列，并设计一对引物用于保守区域。 当我们可以扩增所需的片段时，对PCR产物进行测序。 然后，基于序列数据，设计了与黄檀基因更好匹配的新引物对。 另外，根据需要设计内部引物用于测序。 设计的引物列于补充材料表S4中。

数据分析

首先，为了评估种群的整体遗传结构，我们运行STRUCTURE 2.3（Hubisz et al 2009），该实施贝叶斯聚类算法以找到种群亚结构，种群数K设定为1-7。将每个基因座的单倍型视为等位基因，并将来自所有基因座的数据用于分析。对于每个K，执行十次独立运行，每次运行包括在100,000次迭代的老化之后的100,000马尔可夫链蒙特卡罗（MCMC）迭代。使用CLUMPAK（Kopelman等人2015）汇总每个K的结果数据，并使用STRUCTURE HARVESTER（Earl和vonHoldt 2012）计算数据的平均对数似然性（Pritchard等2000）和Evanno的K（Evanno等人2005）以找到K的最佳值。
使用DnaSP v5（Librado和Rozas 2009）分析比对序列。估计核苷酸多样性（; Nei 1987）和单倍型多样性（Hd; Nei 1987）以评估核苷酸多态性的水平。基于Tajima的D（Tajima 1989），Fu和Li的F和D（Fu和Li 1993），Fay和Wu的H（Fay和Wu 2000）以及Fu的Fs（Fu 1997）的中性测试是为了评估选突变的择性中性。因为我们在每个统计量的基因座测试中进行了多次测试，我们使用p.adjust评估了基于Benjamini-Hochberg程序（Benjamini和Hochberg 1995）的错误发现率（FDR）的结果的统计显着性。 我们根据Benjamini-Hochberg程序（Benjamini和Hochberg 1995）的错误发现率（FDR），使用R版本3.3.2（R核心团队2016）中的p.adjust函数进行多重测试，评估结果的统计显着性。 。为了量化群体分化，使用Hudson等人（1992）的方法估计FST。使用HKA程序（可在https://bio.cst.temple.edu/~hey/ software / software.htm＃HKA获得）进行基于Tajima的D和Fu和Li的D的多轨迹测试。使用TCS ver 1.21（Clement等2000）重建单倍型网络。
假设具有两个群体的基本IM模型（Hey和Nielsen 2004），六个参数（即，发散时间，两个当前和祖先种群的大小，以及两个群体之间每个方向的迁移的两个迁移率）是估计使用IMa2程序（Hey 2010），可在https：//bio.cst.temple.edu/~hey/software/software.htm#IMa2获得。该程序使用聚结仿真和MCMC仿真计算可能性。我们在此分析中没有使用C4H的数据，因为我们怀疑这个基因座受到后面描述的某种选择的影响。计划估计绝对分歧时间需要估计每个基因座每年的核苷酸取代率（Utotal）。为了估计这个速度，我们使用了P. macrocarpus，一种在豆科植物的Dalbergieae部落中的树种，并对该物种中的十个核基因进行了测序。根据Lavin等人（2005），基于由两个cpDNA基因序列和豆科植物化石数据估计的系统发育，估计黄檀物种和大叶黄杨之间的差异时间约为4910万年前（mya）。使用DnaSP将每个核基因座处的D. cochinchinensis和P. macrocarpus之间的每个位点的总替代率（Ktotal）估计为0.0895？.1907（补充材料表S5）。设L是每个基因座的序列长度，T是两个物种之间的分歧时间;那么，Utotal =（Ktotal？L）/ 2T。因此，每个位点的D. cochinchinensis的Utotal估计为0.46？。 11？10-6，几何平均值为1.04？10-6，用于根据IMa2文档中描述的指令估算发散时间。

结果

从所有48个D. cochinchinensis样品，4个D.nigrescens样品和1个P. macrocarpus样品中获得六个叶绿体和十个核基因座的核苷酸序列。

叶绿体位点分析

在6个叶绿体基因座处仅发现一个核苷酸和两个单核苷酸重复多态性（表1）。测序的总长度约为3900bp。除了在SR中，群体是单形的，但群体之间没有共享单倍型，除了KM1和KM2之间，这表明种群之间的种子迁移很少。

核基因座分析

我们使用STRUCTURE来了解种群的整体遗传结构，结果显示在补充材料图S1中。来自所有基因座的数据用于该分析。基于估计的对数似然，群体的最佳数量是K = 4，并且基于Evanno的K，K = 3.当K = 4时，除了从KM2采样的个体之外，来自相同群体的个体聚集在一起。
从使用DnaSP的分析中，我们首先注意到C4H处的核苷酸多样性非常高，这主要是由于该位点的第二个内含子中的小区域181或186bp的非常高的多样性。因为在D. nigrescens中没有发现该区域，所以该区域被认为是在C4H中特异性并固定在D. cochinchinensis中的插入物。然而，D.nigrescens在C4H的相同内含子的不同位置具有插入/缺失多态性，在D. cochinchinensis的固定插入的上游约160bp。插入长297bp，含有回文结构，与D. cochinchinensis的固定插入无相似性;因此，这两个物种中的两个插入物是独立发生的。
D. cochinchinensis C4H的群体遗传统计数据如表2所示。插入区域的沉默核苷酸多样性（sil = 0.0688）比C4H其他区域的高9倍（sil = 0.0077），高12倍比其他9个位点的沉默位点的平均值（sil = 0.0057;表3）。 Fu和Li的D*和F*在插入区域显着为阳性。插入的区域显然是非编码的;然而，序列是回文序列，如果转录，RNA转录物将呈现长茎环的二级结构，类似于原代微RNA（miRNA）（Nozawa等，2012）。二级结构在D. cochinchinensis中是非常保守的，尽管该区域的核苷酸多样性非常高。因此，插入区域内的补偿性突变可能发生以保存结构。因为我们怀疑该区域和因此C4H受到某种类型的自然选择的影响，所以在一些后来的分析中排除了C4H，包括那些使用IMa2的分析。
表3总结了不包括C4H的9个核基因座的多样性测量方法，每个基因座的数值见补充材料表S6。整个群体的沉默位点（sil）和单倍型多样性（Hd）的平均核苷酸多样性分别为0.0057和0.740。中性测试的结果显示在表4和补充材料表S7中。 Tajima的D和Fu以及Li的D和F在各自的位置大多是正的。Tajima的D和Fu以及Li的D对于整个群体的平均值分别为0.907（P = 0.0046）和0.951（P = 0.0018），均为显着正值。这些结果表明群体减少，群体细分或两者兼而有之。
每个群体内的平均核苷酸多样性（sil）范围为0.0027至0.0050，并且低于整个群体中的平均核苷酸多样性（sil）（表3）。值得注意的是，KT中的sil是整个群体的一半。每个群体中的单倍型多样性和单倍型数量也小于整个群体中的单倍型多样性和单倍型数量。因此，每个群体内的遗传变异低于整个群体中的遗传变异。 Tajima的D和Fu以及Li的D和F都是阳性的，除少数位点外（表4）。在SQS中田岛D的值显示在每个KT和KM2群体中显着过量的高频多态性。 Fu's FS在该位点的值显示单倍型的数量显着低于中性期望，基于这些群体中的分离位点的数量。田岛的D在KT和KM2的pi3k显着为负。这些案例可能表明每个人群中的选择性清除。田岛的D和Fu以及李氏D在每个群体中的均值均为正值且具有统计显着性，除了Fu和Li在KT中的D，表明群体规模减少。除了每个群体中的SQS之外，Fu的FS在少数基因座处显着阳性。 FST的估计值显示在表5中。每个位点的估计值在-0.048到0.926之间变化很大，但是跨越基因座的平均值通常很大，范围从0.306到0.467，除了KM1和KM2之间的0.135，它们位于彼此靠近。基于这些结果，建议D. Cochinchinensis种群之间的细分和每个种群的大小减少。前一个观察结果与使用STRUCTURE分析得到的结果一致。
D. cochinchinensis的十个核基因座的单倍型网络如图2所示。网络的形状在基因座之间差异很大。正如高度多样性所预期的那样，在C4H发现了一个复杂的网络。值得注意的是，在这个具有许多私人单倍型的基因座上，群体分化显然很强。在CPK，在SR中发现了非常遥远的单倍型，而在NCED的任何群体中都没有发现这种远程单倍型。

群体历史

假设具有两个群体的IM模型，使用IMa2中实施的基于可能性的方法估计群体之间的差异时间，当前和祖先群体的大小以及迁移率。贡布，KM1和KM2中的两个种群在分析中合并，因为两个种群在地理上彼此接近，大多数单倍型是共享的，并且它们之间的FST相对较低（0.135）。对三个群体的所有对进行了分析，结果如表6和图3所示。在KT和SR之间，发散时间的后验分布模式为68，000年; KM和SR之间有138，000年;和KT和KM之间的113,000年。 KT和SR之间的分歧时间是最近的，尽管最高的后密度（HPD）间隔在种群对之间显着重叠。当前种群的种群大小参数0和1的范围为0.235至0.455。相比之下，每对中祖先种群的种群大小参数A范围为2.885至3.695，比当前种群大7至13倍。尽管迁移参数的模式非零，但95％的HPD都包括零，这表明在所有对中，分裂后群体之间的迁移很弱。

讨论

选择一些核基因座

因为D. cochinchinensis的种群显然经历了最近的大小减少，如田岛的D和Fu和Li的D的均值>0所示并且通过IM分析推断，这些统计数据的任何正显著值（这里，在FDR意义上）可能不会表示偏离中性预期。然而，田岛的SQS D在KT和KM2中具有显着的意义，而其他人群也表现出相同的趋势。此外，SQS（0.061）的FST值平均值在9个位点中最低（表5）。这可以在基因座的单倍型网络中可视地看到。单倍型分为两组，每组中有两组中间频率（图2）。因为IM分析的结果表明群体之间的迁移率非常低，所以通过在群体分裂后平衡选择，可以在每个群体内维持两种类型的单倍型。
相反，一些具有显着负值的统计数据可能表明在基因座上的选择清除，因为最近的大小减少由田岛的D等统计数据的正平均值表示。事实上，田岛的KT和KM2的pi3k的D显着为负（表4）。在这些群体中的这个位点，Fay和Wu的H也是负的并且FST值很高（表5），从而支持最近局部选择性清除的发生。分裂后群体之间的非常弱的迁移可能促进了局部选择性清除的发生。
因为尽管该区域具有高水平的多样性，但二级结构在样品中是保守的，C4H内含子中的插入物很可能是功能性非编码RNA。在拟南芥中，相应的内含子在5端附近具有保守元件，这表明该内含子具有一些功能重要性（Chen等，2007）。目前，我们没有关于该内含子的功能或高度多样性的任何信息。
在其他植物中也报道了具有高水平核苷酸多样性的这种非编码区。例如，Meaux等（2008）发现miRNA，ath-MIR824，在拟南芥中具有高水平的多样性，并且表明高核苷酸多样性是由平衡选择维持miRNA的结构上不同的等位基因引起的。由于Fu和Li在C4H处的插入物的D*和F*显着为正（表2）并且二级结构是保守的，因此某些类型的平衡选择可能是高度多样性的原因。插入物可能是主要的miRNA，但必须进行额外的实验和分析以阐明其生物学意义。

与先前对D. cochinchinensis的研究比较

由于保护问题，先前在泰国，老挝和越南使用不同的遗传标记进行了D. cochinchinensis的群体遗传分析。首先，Soonhuae（1994）使用18个等位酶标记研究了泰国D. cochinchinensis的8个自然种群，平均杂合度和FST的估计值分别为0.229和0.127。本文作者发现了两个群体群，其中一个在泰国东北部，另一个在泰国东北部。其次，Yooyuen等（2012）调查了泰国和老挝10个自然群体中三个叶绿体基因间区域的DNA序列变异，总核苷酸多样性估计为0.00056。这些作者发现泰国有10个种群中有9个共有一个主要单倍型，但剩下的单倍型仅在一个或两个群体中发现，这可能表明当前群体中由于古代大群体的碎片造成的中间水平的遗传分化。最后，Hien和Phong（2012）使用RAPD和ISSR标记对越南的两个种群进行了调查。这些作者估计两个种群之间的FST，相差300公里，为0.31;然而，这个FST值可能过高估计，因为其中一个种群内的多样性接近于零，并且怀疑样本是由克隆组成的。
虽然我们的结果与这三项研究的直接比较很困难，因为所用标记和/或研究人群存在差异，但也注意到了一些共同的特征和差异。首先，虽然D. cochinchinensis目前被分割成小种群，但该物种在核基因座上保持了相当数量的遗传多样性;核基因座的平均沉默多样性为0.0057。其他17种树种中每一种的平均沉默核苷酸多样性范围为0.00003至0.01638，其中树种的平均值为0.00745（Lynch 2006; Iwanaga等2012）。因此，D。cochinchinensis的核苷酸多样性在这些树种中处于中间水平，这与Soonhuae（1994）对同种异体酶的结论一致。
其次，在我们的研究中，核基因座的FST估计值在0.127到0.467之间，而使用不同标记的其他研究的那些也显示出群体之间的中度到强度差异。预期这种分化水平是因为该物种是亲虫性的。此外，扁平的籽荚是风分散的，并且尺寸（长度为5？cm）使得籽荚很难在很长的距离上散开（Niyomdham等1997）。这些特征减少了群体之间的基因流动，并且预计会导致相对高水平的分化。值得注意的是，当FST仅被考虑在相隔超过200公里的种群之间时，我们基于柬埔寨核基因序列的估计高于基于等位酶标记的泰国（Soonhuae 1994）或基于RAPD和ISSR标记的越南（Hien和Phong 2012）。在叶绿体位点，每个种群在柬埔寨都是单形的，具有种群特异性单倍型，而一些种群是多态的，大多数种群在泰国共享一种显性单倍型（Yooyuen等，2012）。因此，虽然通过不同标记获得的核基因座的FST估计可能不具有可比性，但是柬埔寨的D. cochinchinensis种群可能比泰国的分化更强烈。然而，其他国家需要使用核基因序列对FST进行良好估计，以便在整个范围内清楚地了解该物种的种群分化情况。

D. cochinchinensis的种群历史

使用IMa2的估计表明，大约10万年前（kya），柬埔寨的D. cochinchinensis种群显然彼此分离，分裂后基因流动很少。此外，从我们的分析推断出分裂后群体规模与祖先群体的减少。群体规模的减少也得到了每个群体中田岛D的大多数正值的支持。换句话说，在柬埔寨D. cochinchinensis种群中，群体破碎似乎已经发生了100 kya，这种情况一直持续到现在。我们试图将这些群体历史与印度支那过去的环境变化联系起来如下。
D. cochinchinensis一般生长在混合落叶或干燥的常绿森林中，其中出现明显的旱季，12月至3月的降雨事件较少，4月至11月出现雨季（Miyazawa等2014）。估计的时间，约100 kya，群体的分裂对应于持续110至12 kya的最后冰期的早期年龄。主要基于孢粉学研究，印度支那的气候条件可能通常更冷，更干旱。比目前的30至11.9 kya（Cook and Jones 2012）。在最后一次冰期开始时，这一趋势可能会扩展到110 kya，尽管这一时期的信息很少，因为该地区30至110 kya期间的孢粉学数据目前很少。事实上，大中型动物的化石数据表明，中更新世的印度支那土地最有可能是由草地和干燥常绿树林组成的异质栖息地（Louys和Meijaard，2010）。
由于D. cochinchinensis的适宜栖息地有点干旱，气候干旱整个最后一个冰期，为什么在大约最后一个冰期开始时群体中出现裂缝的原因尚不清楚，当我们考虑IMa估计面值时。此外，当时可能会出现扩张，而不是减少。虽然狩猎采集者很可能在印度支那大约43 kya（White等人，2004年），但这些人的影响可能很小，因为他们不依赖农业，并且D. cochinchinensis的硬木很难用原始石轴切割。不幸的是，如上所述，缺乏印度支那40 kya之前的孢粉学数据（Penny 2001），因此难以确定印度支那各地区过去的森林类型。因此，目前，我们无法确定分裂的确切原因和这些种群的减少。

结论

因为我们在本研究中使用了微卫星或等位酶基因座的测序而不是基因分型，我们可以推断出发生在100 kya左右的群体碎片，之后群体之间的基因流非常弱。此外，我们可以找到一些候选基因供选择。虽然我们目前无法确定导致柬埔寨D. cochinchinensis种群分裂的环境因素，但可以获得一些可能有助于保护该物种的见解。首先，群体之间的差异是由于缺乏基因流，而不是基因流和漂移之间的平衡。因此，保持每个当地群体在每个局部适应的变异完整的位置是重要的。其次，除了局部适应的基因座外，还发现受平衡选择影响的基因座（SQS）。如果种群规模变得太小，平衡的多态性可能会丢失（Kimura和Crow，1964）。因此，保持当地群体规模足够大也很重要。最后，将大量群体分成较小的群体并且它们之间缺乏基因流可能持续到最后一个冰期，因此，群体本身的分散状态不太可能与保护有关。
然而，最近D. cochinchinensis种群大小的减少是由人工伐木引起的。虽然目前总群体中的遗传多样性水平仍然很高，因为群体之间的基因流动水平一直很低，如本研究和其他研究所示，自人工伐木开始以来只有几代人已经过去，如果一些当地群体完全丧失，遗传多样性将会很大。此外，在我们获得样本的当前存活的种群中，种群主要由短于15米的幼树组成，而成熟的树木很少见，因为大树被砍伐。因为只有完全成熟的树木才能繁殖，如果大树的伐木仍在继续，那么下一代种群将不会产生，我们在这项研究中报告的遗传变异将会丢失。因此，必须通过保持地理上分离的种群（每种种群都含有成年树木）来设计保护计划以维持适应当地的变异。