CRISPR-Cas9基因编辑

2020年诺贝尔化学奖被授予德国马克斯·普朗克病原学研究所的Emmanuelle Charpentier博士以及美国加州大学伯克利分校的Jennifer A. Doudna博士，以表彰她们在基因组编辑领域的贡献。

我们先对涉及到的名词进行一些了解：

CRISPR（规律成簇的间隔短回文重复序列，Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御，可用来对抗入侵的病毒及外源DNA。

Cas9（CRISPR 相关蛋白 9）是一种双链DNA核酸酶，在guide RNA引导下对靶位点进行切割，诱导DNA中位点特异性双链断裂。

CRISPR-Cas9基因编辑技术，则是对靶向基因进行特定DNA修饰的技术。

CRISPR/Cas9系统由sgRNA（single-guide RNA）和Cas9蛋白两个作用元件组成，sgRNA引导Cas9蛋白识别并切割基因组特定位点形成双链断裂（DSB, double strand break），细胞随之利用非同源末端连接和同源重组修复对双链断裂进行修复。

CRISPR序列结构

CRISPR序列由众多短而保守的重复序列区（repeats）和间隔区（spacer）组成。重复序列区含有回文序列，可以形成发卡结构。而间隔区比较特殊，它们是被细菌俘获的外源DNA序列。

上游的前导区（leader）被认为是CRISPR序列的启动子。

上游还有一个多态性的家族基因，该基因编码的蛋白均可与CRISPR序列区域共同发生作用。因此，该基因被命名为CRISPR关联基因（CRISPR associated，Cas）。Cas基因与CRISPR序列共同进化，形成了在细菌中高度保守的CRISPR/Cas系统。

CRISPR-Cas9基因编辑原理：

在待敲除基因的上下游各设计一条向导RNA(指导RNA)，将其与含有Cas9蛋白编码基因的质粒一同转入细胞中，向导RNA通过碱基互补配对可以靶向PAM附近的目标序列，Cas9蛋白会使该基因上下游的DNA双链断裂。

生物体自身存在着DNA损伤修复的应答机制，将断裂上下游两端的序列连接起来，实现细胞中目标基因的敲除。下图是复合物结构示意图。

应用

CRISPR/Cas9技术是锌指核酸酶（ZFN）及转录激活样效应核酸酶（TALEN）之后的第三代基因组编辑工具。可广泛应用于生物基因组的靶向改造。基因编辑正在用于先天性黑蒙症（LCA）的临床实验中。

高考试题及模拟题

(2020山东高三模拟)CRISPR-Cas9是大肠杆菌等细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御系统，可用来对抗入侵的部分病毒（DNA）及外源DNA．其原理是由一条单链向导RNA引导核酸内切酶Cas9到一个特定的基因位点进行切割。CRISPR--Cas9基因编辑技术是通过设计向导RNA中20个碱基的识别序列，可以对目标DNA上几乎任何一个位置进行删除或添加特定的DNA片段，如下图所示。下列相关叙述错误的是（   ）

A．大肠杆菌等细菌细胞内能合成与入侵病毒（DNA）及外源DNA互补的RNA序列

B．识别序列形成杂交区的过程与转录过程的碱基配对方式相同

C．Cas9能专一性破坏双链DNA分子中碱基之间的氢键来切割DNA分子(单链上的磷酸二酯键）

D．在被切割后的目标DNA中添加特定的DNA片段需要DNA连接酶

【答案】C

(2016高考江苏卷)近年诞生的具有划时代意义的CRISPR/Cas9基因编辑技术可简单、准确地进行基因定点编辑。其原理是由一条单链向导RNA引导核酸内切酶Cas9到一个特定的基因位点进行切割。通过设计向导RNA中20个碱基的识别序列，可人为选择DNA上的目标位点进行切割（见下图）。下列相关叙述错误的是（   ）

A. Cas9蛋白由相应基因指导在核糖体中合成

B.向导RNA中的双链区遵循碱基配对原则

C.向导RNA可在逆转录酶催化下合成（逆转录酶是以RNA为模板合成DNA。）

D.若α链剪切点附近序列为……TCCAGAATC……

则相应的识别序列为……UCCAGAAUC……

【答案】C

如果对CRISPR-Cas9基因编辑想要更多的了解，可以观看视频

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