一、前言

近日，美国圣母大学药物发现与开发中心的Brian Blagg教授在Angew上首次报道了Hsp90α选择性抑制剂的发现。Blagg研究小组成员的主要目标是设计，合成和评估Hsp90蛋白折叠过程的新型抑制剂，已在相关领域发表多篇论文。

二、Hsp90α介绍

分子伴侣具有协助新生肽（客户蛋白）的构象成熟、复活变性蛋白等功能，从而调节蛋白质稳态。热休克蛋白(Heat Shock Proteins , HSPs)是生物体在应激状态(病毒感染、缺氧、DNA损伤、高温、癌细胞等)下诱导合成一组高度保守的蛋白，故又称为应激蛋白，广泛存在于真核及原核生物中。根据同源程度及分子量大小，热休克蛋白可分为Hsp110、Hsp90、Hsp70、Hsp60、小分子Hsp等几个家族，它们具有广泛的生物学功能，在细胞生长、发育、分化、基因转录、蛋白质合成、折叠、运输、分解、细胞骨架功能等多方面发挥重要作用。Hsp90是研究最为广泛的热休克蛋白家族，在细胞内含量丰富, 占细胞蛋白总量的1%～2%。在哺乳动物细胞中，Hsp90具有存在于细胞质中的Hsp90α（诱导型）和Hsp90β（组成型）、内质网中的葡萄糖调节蛋白（Grp94）、线粒体中的肿瘤坏死因子受体相关蛋白1 (Trap1)四种亚型，具有不同功能（图1）。

图1 四种Hsp90亚型的结构和功能

Hsp90单体主要由三个保守的结构域组成：N端(N-terminal domain, NTD)结构域，能够结合ATP或与辅助分子伴侣相互作用，紧连着富含电荷的可变长度连接区域；中间结构域(Middle domain, MD)，含有客户蛋白和辅助分子伴侣结合位点；C端结构域(C-terminal domain, CTD)，其二聚化结构域具有保守的五肽片段(MEEVD)，能够锚定包含三角四肽重复结构域 (tetratricopeptide repeat domain, TPR) 的辅助分子伴侣（图1）。

NTD已成为Hsp90抑制剂的主要作用靶点，通过与Hsp90 NTD的 ATP结合位点竞争性结合，发挥Hsp90活性抑制作用。

三，首个Hsp90α选择性抑制剂的发现

Hsp90负责超过300个客户蛋白的构象成熟，其中许多客户蛋白是致癌转化，生长和转移的关键调节因子。因此，Hsp90已经成为癌症治疗靶点而备受关注，目前已有18种Hsp90抑制剂处于临床研究阶段，但泛Hsp90抑制剂不可避免地产生某些副作用和毒性，阻碍了临床研究进程，因此Hsp90亚型选择性抑制剂的开发已经成为重要的研究方向。Hsp90α亚型选择性化合物的开发为剖析各亚型对相关疾病的作用和Hsp90泛抑制剂的毒性提供了新的工具和方法。

研究表明，敲除Hsp90α基因引起致癌客户蛋白的降解，表明Hsp90α选择性抑制剂能够用于Hsp90α依赖性的癌症治疗。Hsp90α也能分泌到细胞外促进伤口愈合、细胞黏附和炎症反应。高侵袭性肿瘤细胞能够分泌大量Hsp90α，激活基质金属蛋白酶2(MMP-2)进而诱导MMP-3的表达，驱动肿瘤侵袭，因此开发Hsp90α选择性抑制剂具有其独特意义。

图2 Radicicol，AT13387，化合物1，PU-H71，KUNB31的结构

Hsp90α和Hsp90β亚型选择性抑制剂的设计极具挑战性，因为两种亚型在N端ATP结合位点上的同源性大于95%，且在ATP的核苷酸结合位点上仅有52位和91位两个氨基酸存在差异。在先前的研究中，通过分析Hsp90α和Hsp90β的N端ATP结合位点与根赤壳菌素(Radicicol)的相互作用模式，作者确定了Radicicol的间苯二酚部分与Hsp90α和Hsp90β分别具有独特的相互作用，于是以间苯二酚衍生物类泛Hsp90抑制剂AT13387类似物1为先导化合物，首先，对化合物1与Hsp90α和Hsp90β的N-端ATP结合位点相互作用的计算分析表明，化合物1与Hsp90α的Ser52和Ile91形成了三个水分子介导的氢键，而化合物1与Hsp90β中的Ala52和Leu91形成了三个水分子介导的氢键，因此在Hsp90α的Ser52和Ile91周围形成较小的亲水口袋，而在Hsp90β的Ala52和Leu91周围形成较大的疏水口袋。作者利用两个结合位点之间的细微差异，设计并发现了第一个Hsp90β选择性抑制剂KUNB31，但由于Hsp90α中的口袋更小，具有不利的空间位阻作用，因此没能通过类似方式设计Hsp90α选择性抑制剂。因此，Ser52/Ala52的差异是唯一能够用于开发Hsp90α和β选择性抑制剂的突破点(图3C)。由于化合物1对Hsp90α和Hsp90β具有类似的亲和性，因此同样以化合物1为先导化合物进行Hsp90α选择性抑制剂的设计。

图3 化合物1与Hsp90α(A)和Hsp90β(B)的N端ATP结合位点相互作用及Hsp90α和Hsp90β的N-端ATP结合位点的氨基酸序列

进一步分析发现化合物1的间苯二酚部分通过苯环2位的酚羟基与Asp93发生氢键相互作用，4位酚羟基通过水分子A和B与Ser52形成氢键(图3A,B)。因此，作者系统性地移除酚羟基以确定每个酚羟基对亚型结合的贡献，于是设计了化合物2和化合物3(图4)，并进行亚型选择性评估。

图4 化合物2和化合物3的结构及其与Hspα的结合模式

结果表明，化合物3对Hsp90α的亲和力是Hsp90β的大约10倍，而化合物2对Hsp90β的亲和力约为Hsp90α的2倍，因此4位酚羟基对Hsp90α的结合更有利。

图5 基于化合物1的构效关系研究

基于以上结果，接下来，作者通过替换5位的异丙基以调节苯酚部分的空间环境和电子分布，并希望打开Hsp90的诱导型结合口袋 (图6A)。当以Cl取代5-异丙基时导致亲和力降低了大约10倍（4），而替换成碘则完全失去亲和力（5）。在5位引入Br时，选择性最高(大于30倍)且IC50值约为2.73 μM（6），引入-CF3时，可能由于氟和酚羟基的H形成分子内氢键导致化合物7的亲和力降低。当取代叔丁基时亲和力与5相当，证明了球状取代基能够诱导Hsp90α选择性的假设。

研究表明，Hsp90α的ATP结合位点上的位点1是一个诱导型口袋，当没有结合配体或结合不合适配体时处于“Close”状态(如配体化合物1)，当结合合适配体时(如嘌呤类配体PU-H71，格尔德霉素)，则诱导相关的氨基酸发生重排，形成新的结合通道，口袋处于“Open”状态，其内部具有较多疏水残基，是一个疏水性口袋，该口袋对配体的亚型选择性也可能具有重要作用(图6)。于是作者设计化合物10、11和12以探索化合物与位点1的相互作用 (图7)，同时这些化合物也缩短了4-苯酚部分与Ser52之间的距离以增加对Hsp90α的结合亲和力及选择性(图5）。

图6 PU-H71(A), AT13387 (B), 化合物12 (C)与Hsp90α的ATP结合口袋相互作用

结果发现化合物12与Hsp90α的结合亲和力IC50约为4.8 μM，是Hsp90β的20倍以上。如图6所示，PU-H71的亚甲二氧环诱导了位点1的打开(图6A)。与能够诱导位点1打开的泛Hsp90抑制剂PU-H71不同，化合物1能与位点1的关闭构象结合(图6B)。化合物12中5位的苯硫醚部分能够靠近位点1，与PU-H71中到达开放构象位点1的亚甲二氧基部分重叠(图6C)。尽管在Hsp90α和β中都存在相同的位点1，但作者认为苯硫酚上的取代基能够诱导Hsp90α的不同构象，干扰4-苯酚与Ser52的相互作用。于是设计了系列取代苯硫醚类似物并进行Hsp90α的亲和力测试，其中化合物12a和12b分别含有亚甲二氧环和亚乙基二氧环，作者猜测可能与Tyr139形成额外的氢键相互作用(图8a)。

图7 基于化合物12的构效关系研究

结果表明，化合物12a和12b对Hsp90α的亲和力确实提高。同样，含有3,4-二甲氧基苯硫醚的化合物12c对Hsp90α的IC50约为530 nM，选择性约为Hsp90β的22倍。苯硫醚环上不同位置取代甲基的结果表明，3位和4位取代能够提高对Hsp90α的结合亲和力。因此，在苯硫醚环的3位和4位进行取代设计了化合物12d、12e、12f和12g。其中12d和12e对Hsp90α的IC50分别为840 nM和720 nM，而三甲基取代的12f亲和力降低。3-甲氧基-5-甲基取代的12g对Hsp90α的亲和力约为900 nM。3-甲基变为3-乙基时亲和力增加，而3-丙基取代时亲和力降低。为了研究Hsp90α选择性抑制剂与Hsp90α的结合模式，将化合物12b和12d与Hsp90α的N-端结构域进行共晶研究。结果表明，化合物12b的乙二氧环通过保守的水分子与Tyr139相互作用，增加了结合力，而化合物12d不与Tyr139形成额外氢键作用，进一步证明了作者的假设。疏水性的占据位点1能够通过减少熵罚而提高结合亲和力，这可能是12h亲和力增加的原因。同样，4-苯酚通过水分子A和B与Ser52相互作用(图4和9a,b)。因此，包含苯硫醚的化合物对Hsp90α的选择性能够通过非选择性抑制剂化合物1和化合物12b与Hsp90α结合模式的重叠分析得到合理解释。如图9c所示，5位苯硫醚和4-苯酚的存在诱导Hsp90α构象的改变，导致位点1开放。此外，硫醚片段的方向不同于嘌呤类Hsp90泛抑制剂(图9d)。Hsp90α与12b和12d的共晶结构表明，化合物能够诱导4-苯酚靠近Ser52，引起硫醚向腺嘌呤结合口袋移动(图9c)。因此，Hsp90α优先结合含有4-苯酚的苯硫醚衍生物。

图8 化合物12b(a)和12d(b)与Hsp90α的共晶结构，化合物12b和1结合于Hsp90α的重叠共晶结构(c)，化合物12b和PU-H71结合于Hsp90α的重叠共晶结构(d)

利用化合物5和12d进行NCI-60癌细胞筛选，以确定Hsp90α选择性抑制剂的细胞响应。非小细胞肺癌细胞NCI-H522、黑色素瘤细胞UACC-62、卵巢癌细胞SK-OV-3和肾细胞癌细胞UO-31的生长被选择性抑制。用高浓度的12h处理NCI-H522细胞，测定Hsp90客户蛋白的降解情况，Hsp90客户蛋白Her2、Raf-1和Akt的水平以剂量依赖性方式降低。与Hsp90α依赖性的客户蛋白c-Src相比，Hsp90β依赖性的CDK4在更高浓度的12h时才会发生降解，表明在细胞内化合物优先抑制Hsp90α。Hsp90α依赖性的客户蛋白生存素在12h处理时也呈剂量依赖性下降。与Hsp90泛抑制剂(如GDA)相比，Hsp70水平仅有低程度的诱导升高。低浓度的12h能够诱导 Hsp90水平升高，而高浓度时则降低。此外，高浓度12h处理时 HSF1水平也降低了(图10)。

图9 化合物12h处理后，利用Western blot 分析NCIH522细胞中客户蛋白情况，阴性对照DMSO，阳性对照格尔德霉素(GDA, 500 nM)

蛋白或酶亚型选择性抑制剂的设计和开发一直是药物化学中最具挑战性的任务之一，亚型蛋白序列和构象高度相似的情况下尤为如此。配体结合位点仅有两种氨基酸差异的Hsp90α和Hsp90β亚型选择性抑制剂的开发是药物化学家面临重要挑战。先前研究利用两种氨基酸的差异发现了Hsp90β选择性抑制剂，但同样的方法应用于Hsp90α选择性抑制剂的开发并没有取得成功。基于各种酚类化合物的作用分析获得的新型先导化合物3对Hsp90α的选择性约为Hsp90β的10倍。基于此，作者通过基于结构的合理药物设计最终发现了首个Hsp90α选择性抑制剂12h，其Hsp90α抑制IC50为460 nM，选择性是Hsp90β的48倍，能够选择性抑制NCI筛选中多种癌细胞的生长。低浓度时，Hsp90α选择性抑制剂能够诱导Hsp90α依赖性的底物蛋白降解，不影响Hsp90β依赖性的客户蛋白。总之，作者以基于结构的设计策略发现了第一个Hsp90α选择性抑制剂，为Hsp90亚型选择性抑制剂的设计与开发提供了重要方向，具有重要意义。

参考文献：

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