与传统的转录组测序相比，单细胞测序技术噪声很大，使得单细胞转录组数据包含大量的dropout事件（导致基因表达量为0或接近0），即使是一些标记（Marker）基因也有可能表达量很低。当在使用其对聚类的细胞类型进行注释的时候，往往会影响可视化效果。
Nebulosa是一个基于加权核密度估计新出的R包，用于可视化单细胞的数据。它的目的是通过纳入细胞之间的相似性，允许细胞特征的 "卷积"，来恢复丢失的基因信号。
数据准备
首先需要安装和加载相应的包：
if (!requireNamespace("BiocManager", quietly = TRUE))
install.packages("BiocManager")
BiocManager::install("Nebulosa")
library("Nebulosa")
library("Seurat")
测试数据选择10x Genomics 免费提供的外周血单核细胞（PBMC）数据集，约有2700个细胞（https://cf.10xgenomics.com/samples/cell/pbmc3k/pbmc3k_filtered_gene_bc_matrices.tar.gz），下载完解压获得单细胞表达矩阵文件夹。接下来就简单的导入数据对其进行质控啦。
data <- Read10X(data.dir = "filtered_gene_bc_matrices/hg19/")
pbmc <- CreateSeuratObject(counts = data,project = "pbmc3k",min.cells = 3,min.features = 200)
pbmc[["percent.mt"]] <- PercentageFeatureSet(pbmc, pattern = "^MT-")
pbmc <- subset(pbmc, subset = nFeature_RNA < 2500 & percent.mt < 5)
接下来可以进行数据的标准化、降维、聚类，最后可以获得UMAP聚类图（Fig 1），结果保存为.rds文件。具体教程详见我们以往的文章《10x单细胞数据分析之Seurat》。
pbmc <- SCTransform(pbmc, verbose = FALSE)
pbmc <- RunPCA(pbmc)pbmc <- RunUMAP(pbmc, dims = 1:30)
pbmc <- FindNeighbors(pbmc, dims = 1:30)
pbmc <- FindClusters(pbmc)
DimPlot(pbmc, label = TRUE, repel = TRUE)
saveRDS(pbmc,"pbmc.rds")
Fig 1：UMAP聚类图
Marker基因可视化
Nebulosa主函数是plot_density；和Seurat的 FeaturePlot 函数类似。通过下面两条代码，可以简单的对比一下。
plot_density(pbmc, "CD4")
FeaturePlot(pbmc, "CD4")
Fig2：CD4在Nebulosa（左图）和FeaturePlot（右图）的UMAP可视化
可视化结果发现，Nebulosa可视化（左图）会比Seurat自带的绘图函数（右图）效果好很多；同时也表明了CD4+ cell存在相当多的dropout。再加上CD3D可视化结果（Fig3），我们很容易可以判断cluster 0,1为 CD4+ T cell。
Fig 3：CD3D UMAP可视化
数据准备多个Marker基因联合可视化
知道了cluster 0,1是CD4+ T cell，让我们来鉴定Naive CD4+ T cells吧！更复杂的亚群鉴定需要多个marker一起来判定。只需要一行代码，Nebulosa可以将多个marker鉴定的结果组合起来。
plot_density(pbmc, c("CD4", "CCR7"), joint = TRUE)[[3]]
Fig 4：Naive CD4+ T cells鉴定
我们很容易鉴定Naive CD4+ T cells，值得注意的是这些细胞主要包含于cluster 0（CD4+ T cell）(Fig 4)。
熟悉PBMC的读者应该知道，Naive CD8+ T cells（CD8+CCR7+细胞）通常聚集在CD4+CCR7+旁边，与其他CD8+细胞分开。我们也可以验证这一点，下图鉴定了cluster 9为Naive CD8+ T cell，它聚集在CD4+CCR7+旁边(Fig5)。
plot_density(pbmc, c("CD8A", "CCR7"), joint = TRUE)[[3]]
Fig 5：Naive CD8+ T cells的鉴定
总之，Nebulosa对于检测dropped-out genes信号和改善其在低维空间的可视化是有效的，对于基因表达较好的基因，直接基因表达可视化是更好的选择。我们可以多多尝试Nebulosa和Seurat以及Bioconductor中其他可视化方法一起使用，进而得出更加可靠的分析结论。
