对应原版教程4章 http://bioconductor.org/books/release/OSCA/
SingleCellExperiment数据结构（下面简称sce）基于SummarizedExperiment衍生而来，专门用于存储scRNA-seq数据。这是导入测序比对数据到R的第一步，也是之后分析流程的主要对象。
1、sce主要结构组成
如下图所示，我目前对sce结构的理解是，围绕scRNA-seq的原始count数据，储存了4组相关信息
- （1）Assays，即counts表达矩阵的标准化处理的矩阵(可以有任意多种，但常见的也就两三种)；
- （2）colData，即scRNA-seq的每个细胞的信息(例如批次信息、分组信息、表达概况信息)；
- （3）rowData，即scRNA-seq的每个基因的信息(例如表达概况、不同类基因名ID)；
- （4）reducedDims，即每个细胞的降维特征信息(主要有PCA、tSNE、uMAP三类)
2、R包准备与简单构建sce
2.1 R包安装
主要用到两个包：SingleCellExperiment，是构建sce对象的基础包；scater，是分析scRNA-seq的常用工具包之一。
BiocManager::install('SingleCellExperiment')
BiocManager::install('scater')
library(SingleCellExperiment)
library(scater)
值得一提的是加载基于sce的单细胞分析工具包时都会自动加载包括
SingleCellExperiment在内的依赖包。
2.2 简单构建sce
- 简单构建sce对象只需要提供单细胞count表达矩阵即可；
- 如下，模拟一个包含3个细胞，比对到10个基因上的count表达矩阵
counts_matrix <- data.frame(cell_1 = rpois(10, 10),
cell_2 = rpois(10, 10),
cell_3 = rpois(10, 30))
rownames(counts_matrix) <- paste0("gene_", 1:10)
counts_matrix <- as.matrix(counts_matrix) # must be a matrix object!
# cell_1 cell_2 cell_3
# gene_1 17 12 21
# gene_2 14 6 36
# gene_3 12 11 30
# gene_4 8 15 26
# gene_5 15 11 31
# gene_6 9 8 29
# gene_7 8 12 28
# gene_8 7 10 32
# gene_9 9 10 27
# gene_10 6 6 26
- 然后套到下面这个命令里即可
sce <- SingleCellExperiment(assays = list(counts = counts_matrix))
sce
# class: SingleCellExperiment
# dim: 10 3
# metadata(0):
# assays(1): counts
#rownames(10): gene_1 gene_2 ... gene_9 gene_10
#rowData names(0):
#colnames(3): cell_1 cell_2 cell_3
#colData names(0):
#reducedDimNames(0):
#altExpNames(0):
3、sce四组成
3.1 标准化数据之assays
相关函数命令
-
assays(sce)查看当前sce对象的所有assays' name【暂且可理解一种表达矩阵称之为一个assay】 -
assay(sce,"name")查看sce指定一种assay的表达矩阵
针对常见的assay，例如count assay、logcounts assay。SingleCellExperiment包也提供了简单的查询方式，具体如下例。 -
assay(sce,"new_name") = new_assay添加新的assay
assays(sce)
# List of length 1
# names(1): counts
#使用scater包标准化，可直接作用于sce对象；具体为先进行文库因子校正，再log2转换。
sce=logNormCounts(sce)
assays(sce)
# List of length 2
# names(2): counts logcounts
assay(sce,"logcounts")
# cell_1 cell_2 cell_3
# gene_1 4.784105 4.356506 3.705089
# gene_2 4.515174 3.425268 4.435852
# gene_3 4.303259 4.237364 4.186088
# gene_4 3.754379 4.664280 3.991779
# gene_5 4.610498 4.237364 4.230835
# gene_6 3.912376 3.806334 4.139909
# gene_7 3.754379 4.356506 4.092203
# gene_8 3.576925 4.107489 4.274236
# gene_9 3.912376 4.107489 4.042865
# gene_10 3.374543 3.425268 3.991779
counts(sce)
?counts
logcounts(sce)
#模拟一个新的assay
counts_100 <- counts(sce) + 100
assay(sce, "counts_100") <- counts_100 # assign a new entry to assays slot
assays(sce) # new assay has now been added.
3.2 细胞信息之colData
主要包括两类：一是细胞的实验、分组等信息；二是根据表达矩阵概括的每个细胞的表达信息。
相关函数命令有
colData(sce) 查看当前sce对象所有的细胞信息；配合$美元符可方便的用于查看或新添某一条colData。尤其特殊一点是colData(sce)$foo等价于sce$foo
#当前sce有一条sizeFactor cell-info，为scater::logNormCounts时自动添加的
colData(sce)
# DataFrame with 3 rows and 1 column
# sizeFactor
# <numeric>
# cell_1 0.640244
# cell_2 0.615854
# cell_3 1.743902
#添加批次信息
#colData(sce)$batch
sce$batch=c(1,1,2) #注意顺序要一致
colnames(colData(sce))
#[1] "batch" "sizeFactor"
#也可在构建sce对象时，就添加上
cell_metadata <- data.frame(batch = c(1, 1, 2))
rownames(cell_metadata) <- paste0("cell_", 1:3)
sce <- SingleCellExperiment(assays = list(counts = counts_matrix),
colData = cell_metadata)
#利用scater包，注释每个细胞的表达概况
sce <- scater::addPerCellQC(sce)
colData(sce)
# DataFrame with 3 rows and 9 columns
# batch sizeFactor sum detected percent_top_50 percent_top_100 percent_top_200 percent_top_500 total
# <numeric> <numeric> <integer> <integer> <numeric> <numeric> <numeric> <numeric> <integer>
# cell_1 1 0.640244 105 10 100 100 100 100 105
# cell_2 1 0.615854 101 10 100 100 100 100 101
# cell_3 2 1.743902 286 10 100 100 100 100 286
3.3 gene信息之colData
我目前所认识主要包括两类：一是不同种基因ID，二是基因的表达情况
相关函数命令有
rowData(sce)
#利用scater包注释基因的表达情况
sce <- scater::addPerFeatureQC(sce)
rowData(sce)
# DataFrame with 10 rows and 2 columns
# mean detected
# <numeric> <numeric>
# gene_1 16.6667 100
# gene_2 18.6667 100
# gene_3 17.6667 100
# gene_4 16.3333 100
# gene_5 19.0000 100
# gene_6 15.3333 100
# gene_7 16.0000 100
# gene_8 16.3333 100
# gene_9 15.3333 100
# gene_10 12.6667 100
3.4 细胞降维信息之reducedDims
细胞降维信息，简单来说就是根据每个细胞的上千维表达情况压缩成几十个，甚至几个特征属性从而概括这个细胞的表达特征。方式有很多，常见的有三种PCA、tSNE、uMAP
相关函数有
reduceDims(sce) #查看当前sce有几种降维结果
reduceDim(sce, "name") #查看具体某一种降维结果
reduceDim(sce, "new_name") = foo #添加新一种降维结果，不过一个直接在sce对象中添加
reducedDims(sce)
# List of length 0
# names(0):
#利用scater包进行PCA降维
sce <- runPCA(sce)
reducedDims(sce)
# List of length 1
# names(1): PCA
reducedDim(sce, "PCA")
# PC1 PC2
# cell_1 -0.8716428822 -0.4312495
# cell_2 0.8713921135 -0.4316219
# cell_3 0.0002507686 0.8628713
# attr(,"percentVar")
# [1] 57.63049 42.36951
# attr(,"rotation")
# PC1 PC2
# gene_2 -0.62521538 0.35993511
# gene_1 -0.24546126 -0.66840778
# gene_4 0.52198543 -0.16823377
# gene_8 0.30446210 0.33370288
# gene_10 0.02919931 0.45728195
# gene_7 0.34545403 0.02830107
# gene_5 -0.21410318 -0.14912623
# gene_6 -0.06079117 0.21677758
# gene_9 0.11194401 0.02541130
# gene_3 -0.03781870 -0.06506096
4、sce取子集
- 如上，sce的四部分都是基于原始的细胞名和gene名搭建的。
- 如果只取其中一个细胞信息，则其余注释信息也当相应的取该细胞的注释信息；同理对基因筛选也是。
sce
# class: SingleCellExperiment
# dim: 10 3
# metadata(0):
# assays(2): counts logcounts
# rownames(10): gene_1 gene_2 ... gene_9 gene_10
# rowData names(2): mean detected
# colnames(3): cell_1 cell_2 cell_3
# colData names(10): batch sizeFactor ... total foo
# reducedDimNames(1): PCA
# altExpNames(0):
sce[1:2,] #筛选基因
# class: SingleCellExperiment
# dim: 2 3
# metadata(0):
# assays(2): counts logcounts
# rownames(2): gene_1 gene_2
# rowData names(2): mean detected
# colnames(3): cell_1 cell_2 cell_3
# colData names(10): batch sizeFactor ... total foo
# reducedDimNames(1): PCA
# altExpNames(0):
sce[,c(1,3)] #筛选细胞
sce[,sce$batch==1] #根据注释信息筛选
5、简单对比Seurat数据结构
library(Seurat)
scRNA=as.Seurat(sce)
scRNA
# An object of class Seurat
# 10 features across 3 samples within 1 assay
# Active assay: RNA (10 features, 0 variable features)
# 1 dimensional reduction calculated: PCA
scRNA@assays$RNA@counts #对应sce的counts assay
scRNA@assays$RNA@data #对应sce的log2count assay
scRNA@meta.data #对应sce的colData
scRNA@assays$RNA@meta.features #应该对应sce的rowData，但显示为空值
scRNA@reductions$PCA@cell.embeddings #对应sce的reduceDim
subset(scRNA, subset = batch == 1) #利用subset取子集
以上学习了SingleCellExperiment对象结构的基础知识，部分知识点如altExp()、colLabels()、sizeFactors()等到具体应用时再做学习，就不一一介绍了。
至此OSCA的第一部分就到这里了，内容比较少。第二部分就主要聚焦于scRNA-seq的分析流程知识点。
