Nat Biotech | RNA反应元件控制真核转录:合成生物学+细胞工程

原创 图灵基因 图灵基因 今天

收录于话题#前沿分子生物学技术

由Wyss生物灵感工程研究所和麻省理工学院（MIT）的研究人员领导的一个合成生物学家和细胞工程师团队设计了一种技术，使在包括人体细胞在内的靶细胞中选择性地启动基因治疗成为可能。这些方法利用了被称为eToeholds的小型多功能装置，这种装置内置于RNA中，只有在存在细胞特异性或特定病毒RNA时，才能够表达连接的蛋白质编码序列。

这种高度针对性的方法基于病毒用来控制宿主细胞基因翻译的基因元件，可能有助于避免某些影响整个身体的治疗的副作用。研究人员认为，eToehold平台可以为开发更具针对性的RNA疗法、设计体外细胞和组织工程方法以及为感知人类和其他高等生物的各种生物威胁提供多种机会。例如，在癌症治疗中，可以利用eToehold方法设计一个识别癌细胞的系统，然后产生有毒蛋白质，但只能在癌细胞内部产生。

“这为新兴的RNA疗法领域带来了新的控制电路，开辟了下一代RNA疗法，这些疗法可以设计为仅以细胞特异性或组织特异性方式开启。”麻省理工学院医学工程与科学研究所（IMES）和生物工程系的医学工程与科学特聘教授James Collins博士说，“eToeholds不仅可以在人类、植物和其他高等生物中实现更具体、更安全的RNA治疗和诊断方法，还可以作为基础研究和合成生物学的工具。”

Collins是该团队研究的资深作者，该研究发表在《Nature Biotechnology》上，标题为“RNA-responsive elements for eukaryotic translational control”。

在细胞中，RNA的基本功能是将基因编码的信息翻译成蛋白质。然而，RNA的结构复杂性和相对稳定性也让科学家们考虑将这种生物材料作为新型疗法、合成生物标志物和疫苗的基础，第一批针对SARS-CoV-2的mRNA疫苗的开发就证明了这一点。

将合成的RNA分子输送到细胞中，本质上是指导细胞产生所需的蛋白质，然后可以执行治疗、诊断和其他功能。研究人员面临的一个关键挑战是如何确保只有引起或受特定疾病影响的细胞才能表达这种蛋白质。这种能力可以帮助减少不必要的副作用，这些副作用可能与未受影响的细胞和组织中蛋白质的产生有关。

2014年，Collins的团队与Wyss核心教员Peng Yin博士一起成功开发了细菌的立足点开关，该开关在关闭状态下表达，并通过细菌蛋白质合成机制启动所需蛋白质的合成，对特定触发RNA作出反应。该系统的工作原理是引入立足点RNA分子，该分子与编码特定目标蛋白质的mRNA分子的核糖体结合位点结合。（核糖体是根据mRNA指令组装蛋白质的地方。）这种结合会阻止mRNA转化为蛋白质，因为它不能附着到核糖体上。

RNA立足点还包含一个序列，该序列可以与作为触发器的不同mRNA序列结合。如果检测到该目标mRNA序列，则脚趾会释放其抓地力，并将被阻断的mRNA转化成蛋白质。这种mRNA可以编码任何基因，如荧光报告分子。这种荧光信号为研究人员提供了一种可视化的方法，以确定是否检测到了目标mRNA序列。

然而，细菌的立足点设计不能用于更复杂的细胞，包括人类细胞，因为它们的结构和蛋白质合成装置更为复杂。在他们的新研究中，研究人员开始尝试创建一个类似的系统，可以用于真核细胞，包括人类细胞。由于真核细胞中的基因翻译更为复杂，因此它们在细菌中使用的遗传成分无法导入人体细胞。相反，研究人员利用病毒用来劫持真核细胞的系统来翻译它们自己的病毒基因。该系统由称为内部核糖体进入位点（IRES）的RNA分子组成，它可以招募核糖体并启动RNA向蛋白质的转化。

“这些是病毒为了劫持核糖体而开发的复杂RNA折叠，因为病毒需要找到某种方式来表达蛋白质。”共同第一作者Evan Zhao博士解释说，他是Collins团队的博士后研究员，与合作第一作者和Wyss技术开发研究员Angelo Mao博士合作，结合各自在合成生物学和细胞工程领域的专业知识。

IRES是在病毒RNA中发现的有效序列，它允许宿主细胞的蛋白质合成核糖体进入病毒基因组编码病毒蛋白质序列旁边的一段。一旦与RNA结合，核糖体开始扫描蛋白质编码序列，同时通过在其生长末端依次添加相应的氨基酸来合成蛋白质。

研究人员从不同类型的病毒中自然产生的IRES开始，并对其进行改造，使其包含一个与触发mRNA结合的序列。当工程化的IRES被插入到输出转基因之前的人类细胞中时，它会阻止该基因的翻译，除非在细胞内检测到触发mRNA。触发器导致IRES恢复并允许基因被转化成蛋白质。“我们开发了基于RNA的真核模块，称为eToeholds，它能够通过特定trRNA的存在来调节顺式报告基因的转化。这些eToeholds包含经过修饰的IRES，其设计为在与特异性trRNAs的正-反义相互作用引起激活之前处于非活性状态。”该团队解释道。

“在这项研究中，我们采用了IRES（内部核糖体进入位点）元素，这是某些病毒中常见的一种控制元素，它利用真核蛋白质转化机制，并将它们从头开始设计成多功能设备，可以通过编程来感知人类、酵母和植物细胞中的细胞或病原体特异性触发RNA。”研究人员说。

“我们通过引入相互结合的互补序列来形成抑制性碱基配对结构，阻止核糖体与IRES结合，从而向前推进工程IRES序列。”研究人员补充道，“eToeholds中的发夹环编码序列元件的设计使其与与已知触发RNA互补的特定传感器序列重叠。当触发RNA存在并与eToeholds中的补体结合时，发夹环断裂，核糖体可以开始工作并产生蛋白质。”

在快速迭代的过程中，科学家们能够设计和优化在人类和酵母细胞中起作用的eToeholds，以及无细胞蛋白质合成分析。他们使用该技术开发了可以检测人类和酵母细胞内各种不同触发因素的立足点。首先，他们表明他们可以检测到编码寨卡病毒和SARS-CoV-2病毒基因的mRNA。研究人员进一步指出，这项技术的一个可能应用是设计在感染期间检测病毒mRNA并对其作出反应的T细胞。“我们进一步表明，表达eToeholds的稳定细胞系可用于感知自然病毒感染（寨卡病毒）和病毒转录物（SARS-CoV-2结构）。我们还证明了eToeholds通过基于内源性RNA水平选择性激活蛋白质转化来区分不同细胞状态和细胞类型的能力。”

他们还设计了能够检测人类细胞中自然产生的蛋白质mRNA的立足点分子，这有助于揭示细胞状态，如压力。例如，他们表明他们可以检测热休克蛋白的表达，当细胞暴露在高温下时会产生热休克蛋白。“我们发现eToeholds可以检测各种细胞内RNA，包括通过转染或感染引入的RNA，以及内源性转录物，如指示细胞状态或细胞类型的那些。”研究人员说，“如本文所示，当存在细胞类型特异性或细胞状态特异性RNA转录物时，启动所需蛋白质转化的能力具有相当大的治疗潜力。”

研究人员还证明，他们可以通过设计检测酪氨酸酶（一种在黑色素瘤细胞中产生过量黑色素的酶）mRNA的立足点来识别癌细胞，这种靶向性可以使研究人员开发出一种疗法，当在细胞中检测到癌蛋白时，会触发蛋白质的产生，从而引发细胞死亡。

“这个想法是，你将能够靶向任何独特的RNA特征并提供治疗方法。”研究人员说，“这可能是一种限制生物分子在靶细胞或组织中表达的方法。我们设计了专门检测寨卡病毒感染和人类细胞中SARS-CoV-2病毒RNA的eToehold，以及由细胞特异性RNA触发的其他eToehold，例如仅在皮肤黑素细胞中表达的RNA。重要的是，eToeholds和与它们相连的编码所需蛋白质的序列可以编码为更稳定的DNA分子，当引入细胞时，这些分子会转化为RNA分子，并根据我们想要的蛋白质表达类型进行定制。这扩大了eToehold输送到靶细胞的可能性。”

研究人员认为，eToehold平台有助于将RNA疗法和某些基因疗法靶向特定的细胞类型，这一点很重要，因为许多此类疗法都受到过度脱靶毒性的阻碍。“许多核酸靶向疗法的临床应用受到过度脱靶毒性的阻碍。”他们指出，“eToehold模块翻译蛋白质或基于蛋白质的前体以响应mRNA信号的能力将有助于通过将所需疗法的激活限制在特定靶细胞上来应对这一挑战。”

此外，该平台还可以促进体外分化方法，引导干细胞沿着发育途径生成用于细胞治疗和其他应用的特定细胞类型。干细胞和中间细胞沿着许多分化细胞谱系的转化通常不是很有效，而eToeholds可以帮助丰富所需的细胞类型。