比对分析

参考基因组的一些概念：

Seq number：基因组组装的序列总数。
Total length：基因组组装结果总长度。
GC content：碱基G和C的含量。
Gap rate：组装结果中N所占的比例。
N50 length：scaffold N50长度，表示组装结果中有一半的序列长度大于该值。
N90 length：scaffold N90长度，表示组装结果中有90%的序列长度大于该值。

比对统计的一些概念：

Mapped reads：比对到reference上的reads条数（包括单端比对和双端比对）。
Total reads：有效测序数据的reads总条数。
Mapping rate：比对率，比对到参考基因组上的reads数目除以有效测序数据的reads数目。
Average depth：平均测序深度，比对到参考基因组的碱基总数除以基因组大小。
Coverage at least 1X：参考基因组中至少有1个碱基覆盖的位点占基因组的百分比。
Coverage at least 4X：参考基因组至少有4个碱基覆盖的位点占基因组的百分比。

比对分析软件及最重要的软件流程

必做

bwa index # 基因组建索引
bwa mem #比对
samtools/gatk sort #排序

可选

samtools/gatk rmdup #去重
gatk remap # 重call

比对分析统计结果

一般要求：
- 比对率，大部分非异常样品都会在90%甚至99%以上
- 深度，达到合同或者后续分析的需求
- coverage达到一定水平（85%以上）
- 重复率低于20%，这个报告没有，但是我们可以统计，不会提供给客户，但是是内部测评的重要指标

文件格式

fa

基因组文件，记录每条染色体或者contig的序列信息
samtools faidx 后面跟fa文件，可以对其进行建立fai文件及基因的索引文件

>1 dna:chromosome chromosome:AGPv4:1:1:307041717:1 REF
TTTTCGACAAAAATGGGGTTGTGTGGCCATTGATCATCGACCAGAGGCTCATACACCTCA
CCCCACATATGTTTCCTTGCCATAGATCACATTCTTGGATTTCTGGTGGAGACCATTTCT
TGGTCAAAAATCCGTAGGTGTTAGCCTTCGGTATTATTGAAAATGGTCGTTCATGGCTAT
TTTCGACAAAAATGGGGGTTGTGTGGCCATTGATCATCGACCAGAGCTCATACACCTCAC
CCCACATATGTTTCCTTGCCATAGATCACATTCTTGGATTTCTGGTGGAGACCATTTCTT
GGTCAAAAATCCGTAGGTGTTAGCCTTCGTATTATTGAAAATGGTCGTTCATGGCTATTT
TCGACAAAAATGGGGGTTGTGTGGCCATTGATCATCGACCAGAGGCTCATACACCTCACC
CCACATATGTTTCCTTGCCATAGATCACATTCTTGGATTTCTGGTGGAGACCATTTCTTG
GTCAAAAATCCGTAGGTGTTAGCCTTCGGTATTATTGAAAATGGTCGTTCATGGCTATTT
TCGACAAAATGGGGGTTGTGTGGCCATTGATCATCGACCAGAGGCTCATACACCTCACCC

染色体名称
碱基序列信息

fai

基因组的索引文件

1   307041717   55  60  61
2   244442276   312159189   60  61
3   235667834   560675558   60  61
4   246994605   800271245   60  61
5   223902240   1051382482  60  61
6   174033170   1279016481  60  61
7   182381542   1455950259  60  61
8   181122637   1641371549  60  61
9   159769782   1825512952  60  61
10  150982314   1987945621  60  61
...

第一列染色体编号
第二列染色体长度
第三列之前的字符数
第四列非空每行字符数
第五列非空字符数

bam

测序数据比对基因后的二进制文件
因为是二进制文件，将其打开可读模式可以使用：samtools view bam |less 查看

@HD VN:1.5  SO:coordinate
@SQ SN:1    LN:307041717
@SQ SN:2    LN:244442276
@SQ SN:3    LN:235667834
...
@SQ SN:B73V4_ctg187 LN:6454
@SQ SN:B73V4_ctg76  LN:5568
@RG ID:GWAS_85  SM:GWAS_85  PL:ILLUMINA
@PG ID:bwa  CL:/usr/local/sentieon-genomics-201808.01/libexec/bwa mem -M -R @RG\tID:GWAS_85\tSM:GWAS_85\tPL:ILLUMINA -t 32 -K 10000000 /annoroad/ref//Zea_mays.B73_RefGen_v4.dna.toplevel.fa /annoroad/input/23153_R1.fq.gz /annoroad/input/23153_R2.fq.gz  PN:bwa  VN:0.7.15-r1140
@PG ID:sentieon-sort    CL:/usr/local/sentieon-genomics-201808.01/libexec/util sort -r /annoroad/ref//Zea_mays.B73_RefGen_v4.dna.toplevel.fa -t 32 --sam2bam -o /annoroad/out/test//GWAS_85.sorted.bam -    PN:sentieon-sort    PP:bwa  VN:sentieon-genomics-201808.01
A00545:25:H77GTDSXX:4:2240:11026:31767  163 1   15  0   150M    =   115 249 GGGGTTGTGTGGCCATTGATCATCAACCAGATGCTCATACACCTCTCCCCACATATGTTTCCTTGCCATAGATCACATTCTTGGATTTCTGGTGGAGACCATTTCTTGGTCAAAAATCCGTAGGTGTTAGCCATCGGTATAATTGAAAAT  FFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFF,FFFFF:FFFFFFF:FFFFFFFFFFFFFFFFF:FFFF:F:FF,::,FFFFFFFFF,FFFFF,FFF:FFF,FFFFFF:F:FFFF::F:,FFFFFFFFFFFFFFFFFFFFF,FFFFF:FFF  NM:i:5  MD:Z:24G6G13A86T7T9 AS:i:125    XS:i:130    RG:Z:GWAS_85
A00545:25:H77GTDSXX:4:2426:20518:32268  163 1   22  0   150M    =   404 532 TGTGGCCATTGATCATCGACCAGCGGCTCATACACCACACCCCACATATGTTTCCTTGCCATAGATCACATTCTTGGATTTCTGGTGGAGACCATTTCTTGGTCAAAAATCCGTAGGTGTTAGCCTTCGGTATTATTGAAAATGGTAGTT  FFFF:F,:F:FFFFFFFFFFFFFF,:,F::F,,F,FFFFFFFFFFFFF::F::F,F,,F:F:F,FFFF:FFF:F,,FFFFFFF,FF,FFFF,FFF,FFFFF,FFFFFFF,,,F:F:F:FFFFF,FFFF,:,:F,FFFF::FF:F,F::FF  NM:i:3  MD:Z:23A12T109C3    AS:i:136    XS:i:136    RG:Z:GWAS_85
A00545:25:H77GTDSXX:4:1113:1118:7467    99  1   25  2   150M    =   412 537 GGCCATTGATCATCGACCAGAGGCTCATACACCTCACCCCACATATGTTTCCTTGCCATAGATCACATTCTTGGATTTCTGGTGGAGACCATTTCTTGGTCAAAAATCCGTAGGTGTTAGCCTTCGGTATTATTGAAAATGGTCGTTCAT  FFFFFFFF:FFFFFFFFFFF:FFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFF:FFFFFFFFFFFFFF:FFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFF:FFF::FFFF:,FFFFFFFFFF::FF:FFFFFFFFF:FFFFF:FFFFFFFFF  NM:i:0  MD:Z:150    AS:i:150    XS:i:150    RG:Z:GWAS_85
A00545:25:H77GTDSXX:4:2215:13141:24784  163 1   27  0   150M    =   405 527 CCATTGATCATCGACCAGAGGCTCATACACCTCACCCCACATATGTTTCCTTGCCATAGATCACATTCTTGGATTTCTGGTGGAGACCATTTCTTGGTCAAAAATCCGTAGGTGTTAGCCTTCGGTATTATTGAAAATGGTCGTTCATGG  F:FFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFF:FFF:FFFFFFFFFFFF::FFFFFFF:FFFFFFFFF:FFFF,F,FFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFF:F,F,FFF::F:FFF,FFFFF,FFFF:FFFFF,FFF::FF,FFFFF:,  NM:i:0  MD:Z:150    AS:i:150    XS:i:150    RG:Z:GWAS_85
A00545:25:H77GTDSXX:4:2235:25084:19852  163 1   36  0   150M    =   139 248 ATCGACCAGAGGCTCATACACCTCACCCCACATATGTTTCCTTGCTATAGATCACATTCTTGGATTTCTGGTGGAGACCATTTCTTGGTCAAAAATCCGTAGGTGTTAGCCTTCGGTATTATTGAAAATGGTCGTTCATGGCTATTTTCG  FFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFF:FFFFFFFF,FFFFFFF,F:FFFFFFFFFFF::FFFFFFFFFF,F::FF:FFFFFFFFFFF,FFFFFFFFF:F::F,FFFFFFFFFFFFF:FFF:F:F:FFF:,,:FF:F:FFF  NM:i:1  MD:Z:45C104 AS:i:145    XS:i:145    RG:Z:GWAS_85
A00545:25:H77GTDSXX:4:1651:9598:13197   99  1   37  0   150M    =   404 517 TCGACCAGAGGCTCATACACCTCACCCCACATATGTTTCCTTGCCATAGATCACATTCTTGGATTTCTGGTGGAGACCATTTCTTGGTCAAAAATCCGTAGGTGTTAGCCTTCGGTATTATTGAAAATGGTCGATCATGGCTATTTTCGG  FFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFF,:::FFFFFFFFFFFFFFFFFF,FFFFFFFFFFFFFFF,  NM:i:2  MD:Z:133T15A0   AS:i:144    XS:i:144    RG:Z:GWAS_85
A00545:25:H77GTDSXX:4:1503:10285:6590   65  1   38  0   140M10S 9   151394348   0   CGACCAGAGGCTCATACACCTCACCCCACATATGTTTCCTTGCCATAGATCACATTCTTGGATTTGTGGTGGAGACCATTTCTTGGTCAAAAATCCGTAGGTGTTAGCCTTCGGTATTATTGAAAATGGTCGTTCATGGCAATGATCAGC  FFFFF:FFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFF,FFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFF:FFFFFFFFFFFFFFFFFFFFF,,:FFFFFFFFFFFFFFFFFFF,FFFFF,,,,,,,,,,,F  NM:i:1  MD:Z:65C74  AS:i:135    XS:i:135    RG:Z:GWAS_85
A00545:25:H77GTDSXX:4:2474:20907:33912  99  1   40  2   150M    =   421 529 ACCAGAGGCTCATACACCTCACCCCACATATGTTTCCTTGCCATAGATCACATTCTTGGATTTCTGGTGGAGACCATTTCTTGGTCAAAAATCCGTAGGTGTTAGCCTTCGGTATTATTGAAAATGGTCGTTCATGGCTATTTTCGACAA  FFFFFFFFFFFFFFF:FFFFFFFFFFFFFFFF,FFFFF:FFF,:FFFFF,FF,FFFFFFF:FFFFFFFFFFFFFFFF,FFF:FFFFF:FFFFFFFFFFFFF,FFFF:F,FFF:FFF:FFFFFFFF,FFFFFFFFF:FFFFFFFFFF,F:F  NM:i:0  MD:Z:150    AS:i:150    XS:i:150    RG:Z:GWAS_85
A00545:25:H77GTDSXX:4:1673:8115:30608   99  1   45  0   143M1D7M    =   409 514 AGGCTCATACACCTCACCCCACATATGTTTCCTTGCCATAGATCACATTCTTGGATTTCTGGTGGAGACCATTTCTTGGTCAAAAATCCGTAGGTGTTAGCCTTCGGTATTATTGAAAATGGTCGTTCATGGCTATTTTCTACAAAATGG  FFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFF::FFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFF,,FFFFF:FF  NM:i:2  MD:Z:140G2^A7   AS:i:142    XS:i:142    RG:Z:GWAS_85
A00545:25:H77GTDSXX:4:2247:8657:11819   163 1   47  0   98M52S  =   225 275 GCTCATACACCTCACCCCACATATGTTTCCTTGCCATAGATCACATTCTTGGATTTCTGGTGGAGACCATTTCTTGGTCAAAAATCCGTAGGTGTTAGAGCGGACGAGAGTCGTGTATGGACTGTCTGTGATAAACTGTGGAAATATGGG  FFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFF,FFFFFFFFFFFFF,FFFFFFF:FFFFFFFFFFFFFFFF:FFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFF:,,,:,,,F,,,F,F,,:F,FFFF,F,,,,,F,FF,,,F,,,,:,:,,:,FF  NM:i:0  MD:Z:98 AS:i:98 XS:i:98 RG:Z:GWAS_85
...

前面@开头为表头信息
SN记录每条染色体的长度
ID，SM，记录样本信息
PG记录分析的具体命令
非@开头的为比对的reads的具体信息

QNAME：测序的reads的名字。
FLAG：二进制数字之和，不同数字代表了不同的意义；比如正负链，R1/R2（双端测序的哪一端）等。
    1     序列是一对序列中的一个
    2     比对结果是一个pair-end比对的末端
    4     没有找到位点
    8     这个序列是pair中的一个但是没有找到位点
    16   在这个比对上的位点，序列与参考序列反向互补
    32   这个序列在pair-end中的的mate序列与参考序列反响互补
    64   序列是 mate 1
    128 序列是 mate 2

假如说标记为以上列举出的数目，就可以直接推断出匹配的情况。假如说标记不是以上列举出的数字，比如说83=（64+16+2+1），就是这几种情况值和。
RNAME：map到参考基因组后的染色体名称。
POS：1-based 基因组起始位点。
MAPQ：map的质量。
CIGAR：一个数字与字母交替构成的字符串，标记了这段reads不同位置的match情况。不同字母的含义后边介绍。
    standard cigar:
    M match
    I insertion
    D deletion
    extended cigar
    N gap
    S substitution
    H hard clipping
    P padding
    = sequence match
    X sequence mismatch
RNEXT：如果是pair-end测序，这个为mate（另一端中对应的）的read的染色体名称；否则为下一条read的染色体名称。
PNEXT：同上，read对应的起始位点。
TLEN：插入片段大小。
SEQ：序列。
QUAL，ASCII码格式的序列质量;序列的质量信息，格式同FASTQ一样。
后面的其他标签
    AS:i 匹配的得分
    XS:i 第二好的匹配的得分
    YS:i mate 序列匹配的得分
    XN:i 在参考序列上模糊碱基的个数
    XM:i 错配的个数
    XO:i gap open的个数
    XG:i gap 延伸的个数
    NM:i 经过编辑的序列
    YF:i 说明为什么这个序列被过滤的字符串
    YT:Z
    MD:Z 代表序列和参考序列错配的字符串

比对分析及bam文件

比对分析及bam文件

比对分析

参考基因组的一些概念：

比对统计的一些概念：

比对分析软件及最重要的软件流程

比对分析统计结果

文件格式

fa

fai

bam