What?之前不了解这个东西,没有接触过基因重组小鼠实验。偶然发现一篇文章PNAS2014年的(默默感谢那篇文章全体作者),里面有涉及到这个基因重组技术。今天做了文献发表,就在发表的前一天,跟朋友那才了解,获悉Cre-Lox 在动物试验里是很常用的技术。
整理的内容就是目前自己理解的,哪里不对请纠正,含泪万分感谢。也希望给不了解它的人提供一些有帮助的信息。
Cre是最早微生物里发现的基因,它可以编码Cre recombinase一种基因重组酶。Cre重组酶可以识别特异性序列,这个序列被称作Loxp序列,有34bp长(建议维基百科看详细介绍,此处重点)。Cre重组酶会识别到Loxp序列并且修改Loxp之前的基因/序列(取决于Loxp的方向,建议维基百科看详细介绍,此处重点)。经常用这个技术来knockout gene。一般这个基因重组技术会用到杂交,打个比方,父亲老鼠里的某特异性基因A(我们感兴趣的基因,比如细胞态/组织特异表达的基因)里,在胚胎时期被修改并插入Cre基因序列,这样以来它所有细胞的基因组里这个特异基因中都带有了Cre基因序列,Cre基因的表达和翻译受到该特异性基因A的启动子影响,也就是说如果一个细胞里A基因被激活/可以转录的,那么Cre基因也同样被激活/可以转录的。但是,还没完,Cre转录之后目的是编码蛋白啊,一种叫做Cre重组酶的东西,还需要Loxp啊。通常Loxp会在母亲鼠里面,目的是切掉两个Loxp中间的序列或者基因,起到一定的生物学作用。经常被用到的也是我看的这篇文章提到的,胚胎细胞开始在母亲鼠的Rosa26区域/基因的两个外显子之间转入Loxp序列(据说都这么干),Loxp中间是一个STOP基因,这段序列可以阻止下游的基因被转录,类似转录停止位点,还没完,还是在Rosa26基因的两个外显子之间紧随Loxp-stop-Loxp之后,还有一些reporter gene被加入里,报告基因一般包括LacZ,GFP,YFP,etc (如果不了解这些报告基因,建议维基百科看详细介绍,此处重点)。所以说在通常情况下母亲鼠里全体细胞里Rosa26基因都是转录到STOP序列后停止了。还有一点要提的就是,Rosa26这个基因在老鼠里几乎是所有细胞/组织都会转录的(启动子是工作的)但是这个基因没什么大用,所以大家在这里面各种修改添加都不会影响到小鼠的健康问题。那么,现在有了A基因-Cre父亲鼠和Rosa26-Loxp-reporter母亲鼠,接下来就是让他们别闲着造小鼠。他们的孩子就一般标记成A-Cre::RLacZ/ A-Cre::RGFP/ A-Cre::RYFP/ etc,“::”代表的意思是?没错“杂交”,所以这个杂交小鼠一般是研究的目的样品。 因为在这一代出生的小鼠身上同时包含了两处基因被修饰的地方,一个是A基因,一个是Rosa26区域/基因。目的基因A一般应该是特异性的,只在某些细胞或者某些组织特异表达的(一些marker基因),那么在这些A基因表达的细胞/组织里Cre也跟着表达了,因为Cre严格受到A基因的启动子调控,随后Cre的mRNA编码成Cre重组酶出去工作了(细胞主要的功能体现者是蛋白质)。随着Cre重组酶的表达接下来会切断Rosa26两个外显子内,两个Loxp序列之间的STOP基因,所以呢,没错后面的Repoter gene开始转录了,大便通畅的赶脚。所以我们可以通过检测Repoter基因产物可以间接的检测到这些细胞,比如组织染色,in situ hybridization (ISH)染色,荧光检测,etc。这时候可能会问到,那直接在特异基因后添加个repoter gene不就可以轻松搞定了吗?何必这么麻烦,弄来弄去还需要嘿咻嘿咻。重点在这里,不论是加在A基因后的Cre也好,或是直接加个repoter gene也好,他们都会直接/即时的受到A基因的活性调节,非常同步;基因重组小鼠的情况则不然,Cre重组酶表达后会不可逆转的切掉该细胞的STOP基因,repoter gene会持续表达下去,也就是即使后来Cre基因不转录了,你依然会看到repoter gene在该细胞表达,顿时感觉想出这个技术的人太牛了,所以这个基因重组技术通常可以被用于追踪勘测一些细胞态转化分化,“即使你变了我也认得你”。
以上就是总结的关于Cre-Lox基因重组老鼠的技术,当然好多信息没有被提到,粗略浅显就是希望通俗易懂。也是为了转天自己忘了,再看看能提个醒!JS里第一个生物学知识笔记,还会继续坚持。
感谢提到的朋友:LYP 和 WQL。
参考:https://www.biomart.cn/experiment/430/431/439/2285703.htm