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@冻春卷 嗯啊，是一个方面（陷入沉思.jpg），这几天在验证是否因为KO后无功能蛋白的竞争性抑制效果，才导致rescue不能有WT表型，如果这个原因也不能排除的话，可能真的要去做下游的分析了，或者换个细胞系…
谢谢师姐的回复。

CRISPR-Cas9基因敲除实验步骤 Month 4 --可能的收官之帖（但还远未结束）

我的CRISPR-Cas9基因敲除系列实验推文好久没更新了，中间遇到了不少问题，好在都算是一一解决了，细胞在今天早上也已经送出去做测序验证了，希望能有比较好的结果。今天将会把...

冻春卷

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@冻春卷 一开始确实是用的GeCKO时的sgRNA，但因为表型不理想才做的另一种敲除策略，想当对照组。师姐说的关于Western结果，我也觉得可能是功能丧失，因为仔细看了序列，我们切得地方，很后面才出现终止子。现在又又又换了另一种策略。
不过归根结底还是回补实验没有回补成WT的表型……我都开始怀疑筛出来的这个基因到底是不是真的有效基因了

CRISPR-Cas9基因敲除实验步骤 Month 4 --可能的收官之帖（但还远未结束）

我的CRISPR-Cas9基因敲除系列实验推文好久没更新了，中间遇到了不少问题，好在都算是一一解决了，细胞在今天早上也已经送出去做测序验证了，希望能有比较好的结果。今天将会把...

冻春卷

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@冻春卷 谢谢鼓励，师姐的文章真的给我很大帮助。我做的基因是师兄做了GeCKO筛选出来的基因，是跟细胞死亡表型相关的，表型变化是我们自己发现的。一开始选的是所有可变剪接的第一个共同外显子区域切，后来换了另一种策略，在靠后的外显子区域切。puro筛、提基因组pcr、送测都还算顺利。但后面挑单克隆、western验证和rescue实验观察表型变化开始出现各种问题。
我的western结果，KO细胞系与WT没有表达区别，但CCK8实验却是有表型，且两个敲除策略的结果也有差异，最rescue又不是预期的结果……师兄说rescue是最能说明问题的实验，但却没有回补表型。
所以我们又重头去送测看突变情况，这次测序也跟第一次一样，可以确定是双敲，但rescue还是不理想。至于WB结果不是因为蛋白分子量，这个蛋白只有40kda，我现在真的很迷茫_(:з」∠)_

CRISPR-Cas9基因敲除实验步骤 Month 4 --可能的收官之帖（但还远未结束）

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冻春卷

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啊，自己做了CRISPR-Cas9两个月后再来看楼主这篇文章，真的是感慨万千。因为我们组做这个已经有成熟的体系了 ，一开始只是抱着补充背景知识的想法去了解，且看了组里已有的protocol，一开始还觉得很简单……然后就自己去KO了，兵荒马乱的两个多月。真的是每个基因都不一样，同一个基因不同敲除策略产生的表型也会不同，western也不是什么都可以检测，T7的不准确性等等。现在都没有拿到敲除的细胞系……路漫漫qaq

CRISPR-Cas9基因敲除实验步骤 Month 4 --可能的收官之帖（但还远未结束）

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冻春卷

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@冻春卷 感谢回复，你po这篇我看过啦。我师兄说不用去T载体再测，直接可以在这个有杂峰的图里看出来是如何突变的，手动把重叠峰拆开。一开始不明白，这几天已经ok辽，谢谢你的解答。

CRISPR-Cas9基因编辑7--测序验证敲除

前言： 使用挑单克隆技术得到多个单克隆细胞系后，就要开始验证敲除，除了蛋白表达水平的检测，最终还是要看测序结果。关于测序的方案也是各有不同，由于之前选用的是CRISPR-Ca...

冻春卷

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您好，请问挑单克隆后，因为是二倍体，NHEJ后也会出现重叠峰。因为两条染色体会有不同的修复方式，这种测序结果怎么解读呢？我现在就卡在这步，想知道怎么确定敲除成功了qaq

CRISPR-Cas9基因编辑7--测序验证敲除

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